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艽龙胶囊在大鼠体内的药代动力学及组织分布研究

2025-01-17 34 上传者：管理员

摘要：目的分析艽龙胶囊在大鼠体内入血成分及其药代动力学与组织分布特性。方法大鼠灌胃给予1.2 g/kg的艽龙胶囊后，采用HPLC法分析艽龙胶囊在大鼠体内入血成分的组织器官(心、肝、脾、肺、肾、胃、胰腺、大脑、十二指肠、结肠、回肠)10、60、120、240、360、540 min的药物浓度，并用DAS2.0软件计算药代动力学参数。结果入血主要成分为马钱苷酸(Loga)、獐牙菜苦苷(Swert)、6-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷(Glu)、龙胆苦苷(Gent)和獐牙菜苷(Sweroside, Swero)等5种成分；大鼠灌胃给药后，于60 min时各有效成分在血浆及组织中达到较高的浓度，各有效成分在胃肠道中均较高，其中龙胆苦苷含量最高。大脑和肺中含量均较低。结论建立的HPLC法准确、方便，适用于艽龙胶囊在大鼠体内的药代动力学及组织分布的研究；血浆及组织中，尤其是消化器官中上述5种成分含量较高，说明其可能是制剂的主要功效成分。

关键词：
组织分布
艽龙胶囊
药代动力学
马钱苷酸
高效液相色谱法
龙胆苦苷
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艽龙胶囊(西安正大制药有限公司，国药准字Z20030101,规格：每板9粒，共2板)具有清肝泻热之功效，用于治疗功能性消化不良属肝胃郁热证者，症见胃脘饱胀，脘部烧灼，口干口苦等[1]。该产品是我国第一个促全胃肠动力中药新药。临床研究[4-7]报道艽龙胶囊可治疗便秘、癌性腹胀等[2-3],联合用药可更好治疗功能性消化不良、反流性食管炎、消化性溃疡等。经前期研究[8]发现入血主成分为龙胆苦苷(Gentiopicroside, Gent)、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷(6’-O-β-D-Glucosylgentiopicroside, Glu)、马钱苷酸(Loganic acid, Loga)、獐牙菜苦苷(Swertiamari, Swert)和獐牙菜苷(Sweroside, Swero)等。为了进一步了解其在体内的吸收、分布规律，本研究采用HPLC法、组织匀浆法对上述5种成分在大鼠体内的血药分布、药代动力学与组学分布特性进行研究，以此为艽龙胶囊的临床用药提供科学依据。

1、仪器、材料与方法

1.1仪器

岛津高效液相色谱仪LC-2010CHT购于日本岛津公司；BSA124S电子分析天平购于德国赛多利斯公司；TDZ5-WS型低速多管架自动平衡离心机购于湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；Eppendorf Certrifuge 5417R型台式高速冷冻离心机购于艾本德生命科技集团公司，德国；JXFSTPRP-CL高通量组织研磨机购于上海净信实业发展有限公司；XK96-A型快速混匀器购于江苏新康医疗器械有限公司；Milli-Q Academic超纯水系统购于德国Merck Millipore集团公司；HGC-24A型氮气吹干仪购于天津恒奥科技发展有限公司；KQ-5200DE数控超声波发生器购于昆山超声仪器有限公司。

1.2试药

马钱苷酸(批号：160510,含量98.0%)、獐牙菜苦苷(批号：201608,含量98.0%)、6-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷(批号：201606,含量98.0%)、龙胆苦苷(含量98.0%);獐牙菜苷(批号：201609,含量98.0%)均购于上海盛中医药化工有限公司；艽龙胶囊(批号：20170118,由自西安正大制药有限公司提供)。乙腈和甲醇，色谱级，美国Fisher公司提供；肝素钠，乙醚和磷酸，分析纯，由天津市富宇精细化工有限公司。

1.3实验动物

健康雄性SD大鼠30只，体重(220±50)g的2月龄大鼠(饲养条件：饲养室的温度保持在20～24℃,相对湿度在40%～70%之间，要避免阳光直射和强光照射，定期消毒),实验前禁食12 h,自由饮水。

1.4色谱条件

色谱柱：AkzoNobel Kromasil C18(250 mm×4.6 mm 5μm);流动相：乙腈(A)-0.085%磷酸溶液(B),采用梯度洗脱，时间程序为：0～25 min, B 98%～95%;25～40 min, B 95%～90%;40～80 min, B 90%～52%;80～90 min, B 52%～0%。记录时间：90 min;流速：1 mL/min;柱温：25℃;检测波长：238 nm;进样量：20μL。

1.5给药与组织样品采样

将30只SD大鼠随机分为五组，每组6只，按1.2 g/kg的剂量灌胃给药，分别于给药后10、60、120、240、360、540 min后，乙醚微麻，腹主动脉取血后脱颈处死，迅速剖离出心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、胰腺、全脑、十二指肠、回肠、结肠，滤纸吸干表面水分，于-70℃保存备用。

1.6样品处理和分析

取适量组织称重，加生理盐水，将各组织制成400 mg·mL-1的匀浆，于-20℃保存备用；测试前精密吸取大鼠各组织匀浆200μL于离心管，加入3倍量甲醇沉淀蛋白，低温12 000 r·min-1离心10 min;转速，取上清液，用氮气流吹干，残渣用200μL流动相复溶，4℃下12 000 r·min-110 min,取上清液，过0.22μm微孔滤膜，进样20μL HPLC测定。

1.7统计学方法

采用药物与统计(Drug And Statistics, DAS;2.1.1版)软件进行药物动力学参数分析；GraphPad Prism 5.0软件进行统计学处理。

2、结果

2.1专属性

分别吸取200μL对照组血浆(空白血浆)、200μL对照组匀浆(空白组织匀浆)+Loga+Swert+Glu+Gent+Swero、200μL给药后大鼠血浆(组织匀浆),按照“1.6”项下方法处理样品，按“2.1”项下色谱条件测定。结果表明，空白血浆(各组织匀浆)中无干扰成分，且各峰的分离度良好。Loga、Swert、Glu、Gent、Swero分别于19.2、23.9、24.6、28.7、29.2 min时出峰。色谱图见图1。

图1血浆样品HPLC色谱图

注：A.混合对照品+组织样品；B.空白(未给药);C.给药后；1.Loga; 2.Swert; 3.Glu; 4.Gent; 5.Swero。

2.2线性范围

取大鼠血浆及对照组的组织匀浆200μL于离心管中，依次加入适量的标准品溶液；按照“1.6”项下方法处理样品，配制成一系列不同药物浓度的血浆及组织样品，按“1.4”项下色谱条件进行测定。以血浆中Loga、Swert、Glu、Gent、Swero的质量浓度为横坐标，以各标准品的峰面积为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线。结果显示，标准曲线在范围内线性关系良好，r>0.998。见表1。

表1标准曲线及线性范围

2.3精密度和准确度

取200μL大鼠空白血浆及各组织生理盐水匀浆各6份，平均分为日内、日间2组，加入不同浓度的标准品溶液，按照“1.6”项下方法配制成高、中、低药物浓度的溶液，按“1.4”项下色谱条件进行测定，并计算其平均相对回收率。结果显示，所有样品的日内精密度及日间精密度RSD均在5%以内，相对回收率均在95%以上。

2.4稳定性

按照“1.6”项下方法配制待测样品，并测定各成分的浓度，结果血浆(组织匀浆)样品在短期、长期、反复冻融稳定性试验中RSD均在5%以内，回收率均在90%以上。

2.5药代动力学参数

药代动力学实验：取体重180～220 g SD大鼠，实验前12 h内禁食不禁水，称重后以1.2 g/kg的剂量灌胃给药。于给药后5、10、20、30、60、90、120、180、240、360、540 min时用乙醚麻醉大鼠，于大鼠眼底静脉丛取血约0.5 mL,肝素抗凝，以4 000 r·min-1离心15 min,吸取上层血浆，按照“1.6”项下方法处理，按“1.4”项下方法进行HPLC分析。记录峰面积，并按照标准曲线计算药物质量浓度。运用DAS软件对所测得的数据进行血药浓度与时间进行药物动力学拟合计算，获得大鼠灌服艽龙胶囊后各成分的血药浓度—时间曲线图与相关得药物动力学参数。见表2、图2。

表2主要药代动力学参数比较

图2大鼠灌服艽龙胶囊后各有效成分的药时曲线

2.6组织分布实验

将“1.5”项下处死的大鼠迅速取出心、肝、脾、肺、肾、胃、胰腺、脑、十二指肠、回肠、结肠，滤纸吸干表面水分，按照“1.6”项下方法制备样品，按“1.4”项方法进行HPLC分析。结果见图3。以1.2 g/kg的剂量对大鼠灌胃给药后，Loga、Swert、Glu、Gent、Swero在组织中的分布较为广泛，其中Gent在组织中的浓度最高，给药6 min,各组织中药物分布浓度逐渐达到最大值。其中胃肠道中上述5种成分含量最高，其他组织药物浓度普遍偏低。Swert在体内部分组织中含量较低，其中肺和大脑中含量极低，未达到检测限。

3、讨论

胃炎是由多种因素引起的胃黏膜炎症病变，是临床消化系统常见疾病之一[9-10],临床多分为急性和慢性胃炎两大类型。急性胃炎虽然发病迅速，但预后一般良好；如果致病因素持续存在，可以发展为慢性胃炎或者慢性萎缩性胃炎、胃癌等都属于难于根除，易于反复发作的疾病类型[11]。据统计我国人群胃炎发病率高达85%,其中慢性胃炎、消化性溃疡人群患病率分别高达30%、17.2%;根据《2015年中国癌症数据报告》[12],国内每年胃癌新发患者67.9万例，死亡患者49.8万例。积极治疗和预防胃炎，提高人民群众的生活质量迫在眉睫。

由于本实验所研究的药物艽龙胶囊的成品药中含有少量黏合剂，为避免该添加剂对本实验的影响，本试验采用未添加黏合剂的原料药龙胆总苷对实验动物进行灌胃给药，以保证实验中所测数据的准确性和真实性。由于生物样品中存在的大量蛋白质会干扰HPLC对有效成分的含量测定，所以本实验经参考相关文献后，通过对乙腈、甲醇、乙酸乙酯的沉淀效果进行比较，发现用三倍量的甲醇沉淀蛋白时沉淀效果好，操作简便，各目标峰的分离度较好，故确定采用加600μL甲醇直接沉淀蛋白的方法处理血浆及组织样品[13-16]。经预实验得知，动物的性别对本试验没有明显的影响，故本实验采用雄性SD大鼠作为实验动物。

为避免食物对本实验的影响，本实验前期对未禁食和禁食12 h的大鼠分别进行灌胃给药并测定其各个时间点的血药浓度，发现未禁食大鼠的药物达峰时间及血药浓度较未禁食的差别较大，Tmax明显较禁食后的大鼠延长，证明食物对该药物的吸收有较大的影响。结果显示以1.2 g/kg的剂量对大鼠灌胃给药后，五种成分口服给药以后吸收良好，基本都在60 min达到峰值，表明五种成分在吸收特性上较为一致。五种成分的血浆药时曲线均呈单峰形态，表明其均不存在明显的肝肠循环(enterohepatic recirculation)。五种成分在消化道浓度最高，表明艽龙胶囊的有效成分可能直接作用于胃肠道而发挥治疗作用。由于龙胆总苷中的主要成分是Gent,故在动物体内龙胆苦苷的含量明显高于其他成分，由此可证明Gent可能是该药物的主要功效成分。在组织中，胃、十二指肠、结肠、回肠中各成分的含量均较高，大脑、肺和胰腺中各成分的含量均较低，可知该药物主要作用于胃肠道部分，对大脑、肺和胰腺没有明显的影响。

此外除了GLU以外其它四个组分都有相近的t1/2,表明它们可以较快的向组织进行分布从而发挥药效作用。除SM以外其它几个组分在脑组织中均可以检测到，表明其可以透过血脑屏障，因此其在中枢部位可能的作用还需要进一步的研究。Gent在组织中的浓度最高，这与前述血浆浓度分析和艽龙胶囊主要药效成分体外研究结果一致，进一步表明Gent可能是艽龙胶囊的重要药效成分。

现阶段对艽龙胶囊的研究主要是制剂中相关成分的含量测定[17]、对胃肠动力障碍小鼠的影响研究[5]以及对大鼠急性胃溃疡的保护作用及机制研究[18]等。本研究进行在大鼠体内的血药分布、药代动力学与组织学分布特性进行研究，以期为临床更好的使用艽龙胶囊提供依据。

利益冲突说明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

伦理批准及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

实验大鼠由第四军医大学实验动物中心提供[合格证号：SCXK(军)字第2002-005号],动物实验不涉及知情同意。

图3大鼠含药组织药物浓度测定结果（n=6)

参考文献:

[1]中国国家药典委员会.中华人民共和国药典2015版一部[M].中国医药科技出版社,2015,6.

[2]杨磊,袁星星,李莹.艽龙胶囊治疗功能性便秘临床疗效观察[J].中国中西医结合消化杂志,2015,23(5):359-361.

[3]王静.艽龙胶囊联合双歧杆菌治疗功能性便秘的疗效观察[J].现代药物与临床,2017,32(8):1474-1477.

[5]林文明,陈晓艳,陈贵娥,等.艽龙胶囊对胃肠动力障碍小鼠的影响[J].贵州医药,2022,46(3):346-351.

[6]董明芝,刘铁明.艽龙胶囊对大鼠急性胃溃疡的保护作用及机制研究[J].贵州医药,2021,45(7):1030-1033.