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黄连标准汤剂HPLC特征图谱的量质传递研究

2020-10-16 175 上传者：管理员

摘要：目的：建立黄连样品的HPLC特征图谱，阐述其量质传递规律。方法：采用相同色谱条件分别建立23批黄连药材、饮片、提取液、浓缩液、标准汤剂冻干粉、喷雾干膏粉和配方颗粒成品的HPLC特征图谱，比较其相似度;再对其进行定性、定量的量质传递分析，通过K值、损失率的大小和波动性来评价定量传递关系。结果：黄连特征图谱均含有8个色谱峰，其中，峰1为木兰花碱、峰3为非洲防己碱、峰4为药根碱、峰5为表小檗碱、峰6为黄连碱、峰7为巴马汀、峰8为小檗碱;23批样品的相似度均≥0.990，呈现良好的相关性;各过程中K值的波动稳定，实现了稳定的量质传递，损失率≤10%。结论：所用方法准确、稳定、可靠，通过HPLC特征图谱阐述了黄连配方颗粒的量质传递规律。

关键词：
标准汤剂
特征图谱
药学
药根碱
黄连标准汤剂
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《中国药典》中收载的黄连包括毛茛科植物黄连Coptischinensis、三角叶黄连C.deltoideaC.Y.ChengetHsiao和云连C.teetaWall，分别习称为味连、雅连、云连[1]，目前市场上基本以味连为主。黄连中所含的生物碱主要有小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、木兰花碱等[2]。文献曾分别对黄连药材、饮片或标准汤剂进行过HPLC指纹(特征)图谱研究，最终得到的HPLC色谱图较相似[2,3,4,5]。目前并无基于黄连“药材-饮片-提取液-浓缩液-干膏粉-配方颗粒”之间的量质传递研究，黄连配方颗粒质量全程控制的文献报道也较少。2016年国家药典委员会发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，提出将标准汤剂作为中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物，并指出中药材、饮片、标准汤剂、中间体和配方颗粒的特征或指纹图谱应具有相关性。现利用HPLC法建立了黄连药材、饮片、标准汤剂冻干粉、喷雾干膏粉和配方颗粒的特征图谱，并开展从黄连药材到配方颗粒之间的量质传递研究，对其相关性进行评价，为黄连配方颗粒的质量控制提供了依据。

1、实验部分

1.1仪器与试药

U3000高效液相色谱仪(美国赛默飞)。黄连对照药材(批号:120913-201310)及盐酸小檗碱(批号:110713-201212，纯度:86.7%)、盐酸黄连碱(批号:112026-201601，纯度:95.1%);盐酸巴马汀(批号:110732-201611，纯度:86.8%)、盐酸药根碱(批号:110733-201609，纯度:89.5%)等对照品(中国食品药品检定研究院);盐酸表小檗碱(纯度≥99%)、非洲防己碱(纯度≥98%)、木兰花碱(纯度≥99%)等对照品(成都德斯特生物技术有限公司);甲醇、乙腈为色谱纯;水超纯水;其余试剂为化学纯;30批黄连药材分别采自湖北、四川、重庆等黄连药材道地产区，由湖北省药检院鉴定为毛茛科黄连Coptischinensis的干燥根茎，所有样品还经DNA鉴定。

1.2方法与结果

1.2.1样品的制备

取30批黄连药材，按照2015年版《中国药典》中的要求进行炮制加工，制成黄连饮片。经数字本草中医药检测有限公司按2015版《中国药典》中要求全检后，有23批合格(表1)。取23批合格饮片，根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，制备黄连标准汤剂干膏粉和配方颗粒。

1.2.2色谱条件

采用SepaxHP-C18、AgilentZorbaxSB-C18(150mm×4.6mm,5μm)色谱柱，流动相为乙腈-3.5g·L-1磷酸二氢钾溶液(40∶60，每1L含十二烷基硫酸钠1.5g)，检测波长345nm，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5×103。

表123批黄连药材的来源

1.2.3溶液的制备

分别取木兰花碱、非洲防己碱、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为29.57、32.52、34.45、56.94、21.57、25.45、114.85μg·mL-1的混合对照品溶液。取约0.4g黄连药材粉末(过2号筛)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20mL甲醇-盐酸(100∶1)的混合溶液，密塞，称定重量，超声处理(250W,40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇定容，滤过，取续滤液，即得药材供试品溶液。取约0.1g各样品粉末(约相当于药材0.4g，下同)，精密称定，置具塞锥形瓶中，同法制得黄连饮片、标准汤剂冻干粉、喷雾干膏粉和配方颗粒的供试品溶液。精密量取5mL黄连提取液，置100mL量瓶中，加水稀释并定容，滤过，即得提取液供试品溶液。取约0.4g黄连浓缩液，精密称定，置100mL量瓶中，加水溶解并定容，滤过，即得浓缩供试品溶液。

1.2.4HPLC特征图谱的建立

分别精密吸取“1.2.3”项制备的混合对照品及各供试品溶液各5μL，进样测定，记录色谱图，同时进行稳定性、精密度、重复性的考察，结果表明该方法稳定可行。再分别取23批黄连药材、饮片、提取液、浓缩液、标准汤剂冻干粉、喷雾干燥干膏粉和配方颗粒供试品溶液各5μL，进样测定，记录色谱图，以峰面积占总峰面积的2‰进行积分，将色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)，采用中位数法，生成对照特征图谱。经分析可见:黄连药材、饮片的HPLC特征图谱含有8个共有峰，提取液、浓缩液、标准汤剂冻干粉、喷雾干燥干膏粉和配方颗粒均含有9个共有峰，且其中8个峰与药材和饮片的一致。采用混合对照品随行对照，并结合文献确认了7个色谱峰:峰1为木兰花碱、峰3为非洲防己碱、峰4为药根碱、峰5为表小檗碱、峰6为黄连碱、峰7为巴马汀、峰8为小檗碱。由图1可见:药材与汤剂的区别仅在于图1A在1号峰后少一个色谱峰，考虑到其峰面积较少，对图谱整体影响不大，故确定总对照特征图谱为8个共有峰，相似度≥0.990(图2)。黄连饮片的特征图谱与药材类似，黄连提取液、浓缩液、喷雾干燥干膏粉、配方颗粒成品的特征图谱与标准汤剂冻干粉的类似。

图123批黄连药材(A)和标准汤剂冻干粉(B)的HPLC特征图谱

图2黄连的对照特征图谱

1.2.5HPLC特征图谱的量质传递分析

色谱峰定性传递分析:黄连药材、饮片、提取液、浓缩液、标准汤剂冻干粉、喷雾干燥干膏粉和配方颗粒的HPLC对照特征图谱的比较见图3。采用相似度评价软件评价各图谱的相似度，结果见表2。黄连配方颗粒的8个共有峰在黄连饮片、提取液、浓缩液、标准汤剂冻干粉、喷雾干燥干膏粉中均有显示，相关性良好，相似度≥0.999，说明这8个特征成分在黄连配方颗粒制备全过程中可以进行追溯。因此，黄连配方颗粒生产过程中量质传递稳定，物质实现了有效传递。色谱峰定量传递分析:取WL-03批次黄连，分别计算其药材、饮片、提取液、浓缩液、标准汤剂冻干粉、喷雾干燥干膏粉、配方颗粒等色谱图中8个色谱峰的峰面积，计算各样品中各色谱峰的含量，根据比例关系计算各组分的总含量，各组分的总含量与饮片对应峰组分总含量相除，得到各组分相对于饮片的转移率(K)，并计算损失率。损失率=(K提取液-K配方颗粒)/K提取液×100%。由表3可知:8个特征成分的总含量从药材到饮片为炮制切片过程中的正常损失，在可控范围内;从饮片到提取液过程，因提取溶剂为水致使部分成分不能提取完全，转移率明显下降，为正常现象;从提取到浓缩、干燥、制粒过程的损失均较少，损失率≤10%，含量趋于稳定，且整个过程中8个色谱峰无明显增加或降低的现象，说明8个成分在整个过程中无明显分解、富集现象，从而达到稳定的量质传递关系。

图3黄连HPLC特征图谱的量质传递

表2黄连量质传递HPLC特征图谱的相似度

表3WL-03批次黄连特征峰的相对含量(K值)

2、讨论

文中采集的30批黄连样品基本上能代表市场上流通的黄连药材，保证了其来源的可溯性。同时，样品还通过了DNA鉴定，确保了来源的可靠性。文中发现:黄连药材、饮片的HPLC特征图谱含有8个共有峰，而提取液、浓缩液、标准汤剂冻干粉、喷雾干膏粉、配方颗粒成品的HPLC特征图谱均含有9个共有峰，多出的峰在峰1后面，可能是由于黄连提取加热后，某一成分发生分解或反应产生的，但因该峰的峰面积较小，对整体特征图谱的相似度和量质传递无影响。文中通过K值来分析黄连配方颗粒在制备过程中的量质传递规律，能够明显反应出黄连配方颗粒从药材-饮片-提取-浓缩-干燥-成品制备过程中各成分的损失，具有一定的新颖性和创新性。但因未严格按照含量测定方法计算各色谱峰的含量，致使各色谱峰定量传递过程中的K值存在一定误差，但其整体的量质传递规律不会改变。

参考文献：

[1]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2015:303-305.

[2]刘芳,张浩,青琳森,等.HPLC分析不同种质的黄连[J].华西药学杂志,2015,30(3):341-344.

[4]张春艳,成睿珍,刘海.黄连HPLCMaxplot指纹图谱的建立[J].天津中医药,2017,34(8):570-573.

[5]魏屹,丁雪娇,宋良科,等.HPLC指纹图谱法研究峨眉黄连与三角叶黄连[J].华西药学杂志,2012,27(2):193-195.

成焕波,胡辉,孙代华,刘源才.黄连标准汤剂HPLC特征图谱的量质传递研究[J].华西药学杂志,2020,35(05):509-512.