恶性肿瘤因其发病率和死亡率在国内外均呈明显的上升趋势，严重威胁着人类健康[1]。化疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一，但存在缺乏选择性、疗效有限、不良反应大等缺点。多种药物联合治疗、化疗与其他疗法(如放疗、热疗)联合应用，虽然提高了疗效，但效果仍不能令人满意[2]。近年来，抗肿瘤药物经脂质体、聚合物胶束、泡囊等新型给药系统包载有效改善了治疗效果[3,4,5]。顺铂(CDDP)是经典的临床常用抗癌化疗药，抗癌作用强、活性高，毒性谱较为独特，有利于联合用药，但因不良反应大而临床应用受限[6,7]。肿瘤光动力治疗(photodynamictherapy,PDT)是一种选择性相对较高、可控的新型肿瘤治疗方式，其原理是光敏剂受到特定波长激发光照射时，可产生具有细胞毒性的活性氧，代表性药物二氢卟吩e6(Ce6，第二代光敏剂)虽无毒、正常组织清除快、对光的不良反应弱，但吸收差、易降解，影响了其临床疗效[8,9]。鉴于脂质体可提高药物的组织相容性，对肿瘤细胞的亲和性与靶向性、缓释性好等性质，设计并制备CDDP和Ce6两种药物共包载脂质体(PC-Lip)，将CDDP包载于脂质体的核心水相中，Ce6包载于脂质双分子夹层中，形成的共包载脂质体PC-Lip同时具有化疗和光动力作用[10,11]。药物制成脂质体后，可增加细胞摄取，当用近红外光照射时，光敏剂产生显著的光动力，促进化疗药物转运入胞浆进而进入细胞核，产生抗肿瘤效应，从而促进化疗和PDT两种治疗手段的优势互补[12]。现以薄膜分散法制备PC-Lip，并对其理化性质及体外细胞水平的抗肿瘤效果进行了研究[13]。

1、实验部分

1.1仪器、试药与细胞

2600型紫外分光光度计(日本岛津);电感耦合等离子体发射光谱仪(美国瓦里安);660nm近红外激光器(长春雷仕光电有限公司);HT7700透射电子显微镜(日本日立);激光粒度分析仪(英国马尔文);全波长酶标仪(美国伯乐);710型共聚焦荧光扫描显微镜(德国卡尔蔡司);恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造公司)。顺铂(CDDP，苏州格瑞特医药技术有限公司，含量98.5%);二氢卟吩e6(Ce6，上海百灵威试剂有限公司，含量98.0%);胆固醇(国药集团化学试剂有限公司，含量98.0%);大豆磷脂(上海麦克林生化科技有限公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT，上海江莱生物科技有限公司);Hoechst33342、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(上海碧云天生物技术公司);活性氧(ROS)试剂盒(DCFH-DA，大连美仑生物技术有限公司);改良型RPMI1640完全培养基(Hyclone，美国Thermo);抗CDDP修饰的DNA抗体(CP9/19，一抗)、山羊抗大鼠IgG(AlexaFluor488，荧光二抗)(英国Abcam);其余试剂为分析纯。4T1小鼠乳腺癌细胞(苏州大学纳米学院)。

1.2方法与结果

1.2.1脂质体的制备

称取处方量大豆磷脂、胆固醇和Ce6，置250mL茄形瓶中，溶于三氯甲烷/甲醇混合液中，置40℃水浴中旋转蒸发成膜，加入10mL顺铂贮备液(1mg·mL-1，溶剂为0.9%氯化钠溶液)，于45℃搅拌水化1h，超声，用微孔滤膜过滤，得共包载CDDP和Ce6脂质体混悬液(PC-Lip，二者浓度比4∶1)。同法制备空白脂质体、单包载CDDP脂质体(CDDP-Lip)和单包载Ce6脂质体(Ce6-Lip)。

1.2.2脂质体的形态、粒径、Zeta电位及包封率考察

取“1.2.1”项制备的脂质体溶液，用透射电镜观察其形态。由图1可见:PC-Lip形态规整，为较均匀的球形颗粒;Ce6-Lip、CDDP-Lip、空白脂质体与PC-Lip类似。用激光散射粒径仪测定，各类脂质体均为单峰分布，其粒径、粒径分布及电位数据见表1。PC-Lip的平均粒径为80.1±2.1nm，水合粒径为128.9±4.1nm，多分散系数PDI为0.170±0.015，表面电位为-9.94±0.72mV，说明脂质体粒径较均一、分散性好，粒子间因存在约-10mV静电斥力，可避免聚集，有利于稳定和储存，又有表面水化层且粒径<200nm，提示脂质体具有体内EPR效应和对肿瘤的被动靶向潜力。PC-Lip及Ce6-Lip离心后，取上清液，加甲醇，用紫外分光光度仪测定吸光度并计算Ce6的浓度;取PC-Lip及CDDP-Lip各100μL，硝解，用电感耦合等离子体发射光谱仪测定CDDP的浓度，根据公式“包封率(EE)=脂质体中包封的药物量/药物总量×100%”，计算药物包封率，结果PC-Lip中CDDP、Ce6的包封率分别为80.14%±5.20%、95.48%±1.02%(表1)。

图1PC-Lip的透射电镜图

表1各脂质体的表征

1.2.3脂质体中药物的体外释放考察

以透析法考察，将样品液置透析袋(相对截留分子量MWCO=3.5kDa)中，放入pH7.4PBS(模拟生理环境)和pH5.5PBS(模拟肿瘤环境)中，在37℃、120r·min-1恒温振荡透析，于各时间点取出透析液并补充等量空白缓冲液。按“1.2.2”项方法，分别用紫外分光光度仪和电感耦合等离子体发射光谱仪测定并计算Ce6、CDDP的累计释放量。对释放数据进行零级、一级、Higuchi和Weibull方程拟合，考察CDDP和Ce6在pH5.5PBS、pH7.4PBS中的释放规律。由PC-Lip中CDDP的释放规律可见:Weibull方程在pH7.4PBS、pH5.5PBS中的释放曲线拟合度均较好，释放T1/2分别为16.85、14.88h，缓释作用显著，且模拟肿瘤细胞环境使释放加快，提示有利于药物进入胞浆，发挥细胞毒作用，从而杀死肿瘤细胞;Ce6释放规律的考察结果也表明:Weibull方程对PC-Lip在pH7.4PBS、pH5.5PBS中的释放方程拟合度均较好，释放T1/2分别为39.09、135.46h，缓释显著，但在模拟肿瘤细胞环境中释放较慢。两种药物的体外释放规律均符合Weibull方程，与微粒的释药特点相吻合。

1.2.4肿瘤细胞对脂质体中药物摄取量的影响

为考察脂质体经内吞进入肿瘤细胞的药量，取对数生长期的小鼠乳腺癌细胞4T1，用胰酶消化，加入RPMI1640培养基，混匀后，接种于6孔细胞板中，每孔5×105个细胞，置37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞覆盖约90%后，分别加入PC-Lip、Ce6-Lip、CDDP-Lip及游离CDDP/Ce6混合液(二者浓度与PC-Lip一致)，孵育后去除培养基，用PBS清洗，胰酶消化，加入PBS分散并收集细胞，统计各孔细胞数量，用超声粉碎机(400W、120s)粉碎细胞，粉碎液经甲醇沉淀蛋白后取上清，用紫外分光光度仪检测并计算Ce6的摄取量。另取细胞破碎液硝解后，用电感耦合等离子体发射光谱仪检测CDDP的摄取量。4T1细胞24h对脂质体中两种药物的摄取量见图2，游离药物、单包载及共包载脂质体中CDDP的摄取量(每106个细胞)分别为0.22、0.89、0.91μg，包载后分别增加了4.0、4.1倍;每106个细胞的Ce6摄取量分别为0.07、0.17、0.23μg，包载后分别增加了2.4、3.3倍。共包载脂质体PC-Lip中，CDDP经脂质体包载后，摄取量与相应单包载脂质体相似，而Ce6与相应单包载脂质体比较，摄取量大大提高。

1.2.5脂质体体外细胞毒性的考察

用MTT法考察脂质体的细胞毒性。取4T1细胞接种于96孔板中，每孔5×105个细胞，置37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞覆盖约90%后，分别加入PC-Lip、CDDP-Lip、Ce6-Lip及游离CDDP/Ce6混合液孵育，浓度为0.1～10.0μg·mL-1(以Ce6浓度计);光照组经光照后继续培养，非光照组不光照，其余培养条件同光照组。加入噻唑蓝溶液和完全培养基，培养并处理后，用酶标仪于490nm处测定吸光度，以未加药的细胞为阴性对照组，计算细胞存活率=OD实验组/OD阴性对照组×100%。以药物浓度为横坐标、细胞存活率为纵坐标作图(图3)。非光照条件下，Ce6的浓度不影响肿瘤细胞的存活率，说明Ce6无暗毒性;CDDP对肿瘤细胞的细胞毒性呈剂量依赖性，且PC-Lip、CDDP-Lip、CDDP/Ce6组的半数致死量(IC50，以CDDP计)分别为3.00、3.09、2.86μg·mL-1(图3A)。光照条件下，除CDDP-Lip保持不变外，PC-Lip、CDDP/Ce6、Ce6-Lip组的IC50(以Ce6计)分别为0.26、0.52、1.41μg·mL-1(图3B)。上述结果说明:药物被脂质体包载后，细胞毒性显著增强;经光照后，共包载脂质体PC-Lip中Ce6的细胞毒性远远大于单包载(IC50降低5.4倍)，也显著大于同时具有化疗和光动力作用的游离CDDP/Ce6组(IC50降低2倍)，即PC-Lip保持了单包载CDDP的化疗效果，并大幅提升了单包载Ce6的光动力疗效。

图24T1细胞对CDDP(A)和Ce6(B)的摄取量

图3非光照(A)和光照(B)条件下各组细胞的存活率

1.2.6脂质体对肿瘤细胞内ROS的影响

ROS是光敏剂发挥细胞毒性的重要指标，利用ROS检测试剂盒的荧光探针DCFH-DA检测ROS。DCFH-DA无荧光，能穿过细胞膜进入细胞，被细胞内的酯酶水解生成DCFH，再被活性氧氧化后转变成显绿色荧光的DCF。将4T1细胞分别加入含有PBS、PC-Lip、Ce6的培养基孵育，用无血清1640培养基清洗，加入DCFH-DA孵育;光照组进行光照后，两组均加入Hoechst33342溶液染细胞核，用激光共聚焦显微镜观察并统计绿色荧光。各组细胞核被Hoechst染成均匀的蓝色，细胞内光照前后DCF绿色荧光的强度发生了改变(图4A)。结合荧光强度图(图4B)可知:光照后，PBS组的荧光强度从0.3变为0.7，变化可忽略;游离Ce6组从11.3变为19.3，增加1.7倍;PC-Lip组从10.3变为68.0，增加6.6倍;PC-Lip光照组比游离Ce6光照组增加了83.5倍，产生ROS的能力显著增强。

1.2.7脂质体对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响

用线粒体膜电位检测试剂盒的JC-1为荧光探针，JC-1从膜电位较高的显红色荧光的聚合物，变为膜电位较低的显绿色荧光的单体，从而反映膜电位下降，并作为肿瘤细胞早期凋亡的检测指标。将4T1细胞接种至24孔板中，分别加入PBS、PC-Lip、Ce6-Lip及CDDP/Ce6混合液，孵育后，光照组进行光照处理。两组细胞继续孵育后，加入JC-1染色液并按照试剂盒说明书操作，Hoechst33342染核后，用激光共聚焦显微镜观察。由图5可见:细胞核均被染成蓝色，且PBS组光照前后几乎无绿色荧光;红色荧光强度高且无明显变化，为正常线粒体的膜电位;Ce6-Lip非光照组类似，红/绿荧光百分比值(膜电位变化最小)几乎100%;PC-Lip非光照和CDDP-Lip非光照组相似，发挥的是化疗作用，绿色荧光增强，膜电位下降较多;紧随其后的是CDDP/Ce6光照、Ce6-Lip光照组。总体来看，尽管这几组的比值相近，但同样是脂质体包载，单纯化疗的膜电位降幅略大于单纯光动力治疗。未用脂质体包载的CDDP/Ce6光照组能同时发挥两种疗效，膜电位降幅为17.4%，大于仅有化疗作用的CDDP/Ce6非光照组;膜电位变化最大的共包载PC-Lip光照组，红色荧光几乎全部转化为绿色荧光，膜电位为3.9%;两组比较，脂质体的包载可使膜电位下降4.46倍，说明对肿瘤细胞产生的强大杀伤力，源自其有效降低线粒体膜电位，促进细胞凋亡。

1.2.8脂质体对肿瘤细胞CDDP-DNA加合物形成的影响

CDDP的作用靶点为肿瘤细胞存在于胞浆线粒体和细胞核中的DNA，可与DNA中的嘌呤碱基生成不可修复的CDDP-DNA加合物，干扰细胞DNA的复制和转录，引发细胞损伤[14]。通过免疫荧光染色考察CDDP-DNA加合物的形成，评估脂质体导致肿瘤细胞损伤的作用。向4T1细胞中分别加入PC-Lip、CDDP-Lip及CDDP/Ce6混合液孵育后，光照组进行光照处理。两组细胞均用多聚甲醛固定并洗涤后，加入TritonX-100增加细胞膜通透性，用BSA封闭30min，加抗顺铂(CP9/19)一抗，加AlexaFluor488标记的二抗孵育完成后，用Hoechst33342染核并用激光共聚焦荧光显微镜观察。免疫荧光染色(图6A)可见:细胞核被染成均匀蓝色，形成的CDDP-DNA加合物为绿色;光照和脂质体包载，均可促进CDDP-DNA加合物的形成，使绿色荧光增强;且光照后，PC-Lip细胞核中形成大量的绿色CDDP-DNA加合物，与深蓝色细胞核重合后显现出强烈而独特的浅蓝光。从图6B可知:PBS、CDDP/Ce6、CDDP-Lip、PC-Lip、CDDP/Ce6光照、PC-Lip光照组中CDDP-DNA加合物的绿光强度分别为2.5%±0.4%、60.8%±1.4%、70.6%±1.8%、72.6%±1.1%、77.3%±0.5%、90.3%±0.2%，可见非光照组仅有化疗作用的CDDP-Lip、PC-Lip组的强度相近，但均强于游离CDDP/Ce6非光照组，说明脂质体具有可提高化疗疗效的潜力;光照组同时具有化疗和光动力作用的PC-Lip光照组强于游离CDDP/Ce6光照组，并都强于非光照组，增加了13.0%的CDDP-DNA加合物产生。说明PC-Lip促进肿瘤细胞损伤，与其能够更有效地使CDDP与肿瘤细胞核中DNA结合有关。

2、讨论

为实现化疗/光动力治疗的优势互补，高效低毒治疗肿瘤，文中制备了顺铂(CDDP)、二氢卟吩e6(Ce6)共包载的脂质体(PC-Lip)。PC-Lip脂质体的形貌、粒径、包封率均符合被动靶向给药系统的要求。在包封率研究中，尽管两种药物分别亲水和亲脂，似乎应各自分别进入脂质体的核心水相或脂质双分子夹层中互不干扰，完成自组装形成脂质体，但事实上却是药物的包封率受药物性质及药脂比影响。当大豆磷脂、胆固醇和Ce6质量比为80∶20∶2，且CDDP和Ce6质量比为5∶1时，PC-Lip所包载的两种药物的包封率比单包载CDDP增加4.66%，比单包载Ce6增加10.27%，有利于药物的高效递送，其机制值得深入探讨。也有研究发现:当药脂比为1∶10时，在双包载阿霉素(Dox)和血卟啉单甲醚的脂质体中，Dox的包封率较单包载Dox增加了15.3%[12]。体外释放结果表明:PC-Lip中两种不同性质药物的体外释放规律均符合Weibull方程，具明显缓释效果。且脂质体中CDDP的释放T1/2在模拟正常细胞(pH7.4PBS)中大于模拟肿瘤细胞(pH5.5PBS)中，有利于疗效发挥;但脂质体中Ce6的释放T1/2却相反，在模拟正常细胞中小于肿瘤细胞中。这是因为Ce6是酸性分子，在pH7.4PBS中成盐，易溶而释放相对容易;在pH5.5PBS中是溶解度小释放慢的分子状态，是由结构决定的性质，因此，需要在后续实验中关注脂质体中Ce6的释放慢是否影响其治疗作用。细胞摄取实验表明:肿瘤细胞对PC-Lip的药物摄取量均显著增加，提示共包载可极大地提高两种游离药物的疗效。细胞毒性结果表明:光照后，共包载脂质体PC-Lip中Ce6的细胞毒性远远大于单包载，也显著大于兼具化疗和光动力作用的游离CDDP/Ce6，即PC-Lip保持单包载CDDP的化疗效果，并大幅提升了Ce6的光动力疗效，体现了较强的化疗-光动力协同增益作用;说明PC-Lip光动力疗效得到了提高，关键是Ce6被脂质体包载后易于进入肿瘤细胞，而不受释放影响。光照后，PC-Lip比游离Ce6产生活性氧(ROS)的能力显著增强，说明PC-Lip显著提升了对肿瘤细胞的杀伤作用，可能是Ce6经脂质体包载后大幅提高的ROS量，再次说明了Ce6的释放不影响PC-Lip的光动力疗效。因兼具化疗和光动力作用，药物被脂质体包载后，加剧膜电位下降，验证了PC-Lip可有效降低膜电位，促进细胞凋亡。光照下，PC-Lip可以促进CDDP在肿瘤细胞核中大量形成CDDP-DNA加合物，不仅验证了CDDP的抗肿瘤机制，还显示PC-Lip可提高Ce6的光动力作用。并且由于脂质体中Ce6的存在，提高了进入肿瘤细胞核的CDDP量，增强了化疗效果。因此，文中设计的PC-Lip兼具化疗和光动力作用的联合给药系统，可实现优势互补，发挥相互促进的协同效应，具有研制高效低毒抗肿瘤新制剂的潜力。

图4激光共聚焦显微镜观察4T1细胞的DCF荧光图(A)和荧光强度(B)

图5激光共聚焦显微镜观察4T1细胞线粒体膜电位的变化

图6激光共聚焦显微镜观察4T1细胞中铂-DNA加合物的荧光图(A)和荧光强度(B)

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