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右美托咪定通过Sirt1信号通路对溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜损伤影响

2025-01-28 33 上传者：管理员

摘要：目的探讨右美托咪定（Dex）对溃疡性结肠炎（UC）小鼠肠道肠黏膜损伤及沉默信息调节蛋白1(Sirt1)信号通路的影响。方法将50只SPF级雄性小鼠按照随机数字表法分为对照（Ctrl）组、模型（Model）组、右美托咪定（Dex）组、Sirt1信号通路抑制剂EX527(EX527)组、右美托咪定+EX527(Dex+EX527)组，每组10只。采用饮用2.5%葡聚糖硫酸钠盐（DSS）溶液诱导建立小鼠UC模型。造模完成1 h后，按照20μg/kg Dex剂量腹腔注射Dex组小鼠，Dex+EX527组小鼠按照20μg/kg Dex剂量注射后，再通过腹腔注射2 mg/kg EX527,Ctrl组和Model组分别给予等体积的生理盐水腹腔注射。记录小鼠体质量变化、粪便性状及大便隐血情况，计算疾病活动指数（DAI）；苏木精-伊红（HE）染色观察各组小鼠肠黏膜病理学变化；酶联免疫吸附实验（ELISA）检测各组小鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平和各组小鼠肠黏膜组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量；TUNEL检测各组小鼠肠黏膜细胞凋亡；Western blot检测各组小鼠肠黏膜组织中Sirt1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)蛋白。结果与Ctrl组比较，Model组小鼠出现黏膜上皮细胞变性、坏死、炎症细胞浸润、肠黏膜明显充血、水肿等病理改变，DAI评分、血清中TNF-α、IL-6水平、MDA含量、细胞凋亡率[（18.67±3.12）%比（2.89±0.54）%]显著升高，SOD活性、Sirt1(0.25±0.02比0.93±0.14)、PGC-1α(0.18±0.01比1.12±0.10)蛋白相对表达量显著降低（P<0.05）；与Model组比较，Dex组UC小鼠肠道肠黏膜损伤减轻，DAI评分、血清中TNF-α、IL-6水平、MDA含量、细胞凋亡率[（7.78±1.12）%比（18.67±3.12）%]显著降低，SOD活性、Sirt1(0.85±0.16比0.25±0.02)、PGC-1α(0.97±0.08比0.18±0.01)蛋白相对表达量显著升高，而EX527组对应指标与上述相反（P<0.05）；与Dex组比较，Dex+EX527组UC小鼠肠道肠黏膜损伤严重，DAI评分、血清中TNF-α、IL-6水平、MDA含量、细胞凋亡率[（12.43±2.01）%比（7.78±1.12）%]显著升高，SOD活性、Sirt1(0.59±0.08比0.85±0.16)、PGC-1α(0.67±0.05比0.97±0.08)蛋白相对表达量显著降低（P<0.05）。结论 Dex可能通过激活Sirt1信号通路，减轻UC小鼠肠道肠黏膜损伤。

关键词：
右美托咪定
沉默信息调节蛋白1信号通路
溃疡性结肠炎
肠黏膜损伤
腹痛
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溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）是以腹痛、腹泻和直肠出血为主要表现的慢性炎症性肠病，如果不及时治疗，会增加患结肠癌的风险[1]。许多研究已表明UC的潜在机制包括炎症细胞的浸润、T细胞的激活、促炎细胞因子的诱导和氧化应激[2]。但目前治疗溃疡性结肠炎的药物只能消除症状，不能从根源上治愈结肠炎[3]。右美托咪定（Dexmedetomidine,Dex）是一种α2⁃肾上腺素能受体激动剂，其能选择性地通过激动人体广泛分布的α2肾上腺素受体产生镇静、催眠、镇痛、抑制交感神经等作用[4]。据报道，Dex对坏死性小肠结肠炎大鼠具有保护作用[5]，而沉默信息调节蛋白1(Silentinformationregulator1,Sirt1）信号通路是Dex发挥作用的分子机制之一，相关研究显示，Dex通过激活Sirt1信号通路减轻大鼠创伤性脑损伤[6]，而Dex能否通过调控Sirt1信号通路来发挥对UC的保护作用尚未见报道。因此，本研究旨在探讨Dex对UC小鼠肠道肠黏膜损伤的影响，以期为Dex治疗UC提供理论依据。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

50只SPF级雄性小鼠，体质量为（25±3) g，购自中山大学附属第一医院（生产许可证：SCXK（粤）2020⁃0056），动物实验经实验动物伦理委员会批准（批准文号20220901），所有动物实验均遵循3R原则。

1.1.2主要试剂

右美托咪定（上海皓鸿生物医药）、葡聚糖硫酸钠盐（Dextran sodium sulfate,DSS）（南京沃博生物科技）、BCA蛋白定量试剂盒（上海酶联生物），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、MDA试剂盒、SOD试剂盒、HE染色液（北京索莱宝科技），ECL化学发光试剂盒（美国Sigma），兔源Sirt1、PGC⁃1α、GAPDH抗体（美国Abcam），等。

1.2方法

1.2.1分组与造模将

50只小鼠随机分为对照(Ctrl）组、模型（Model）组、Dex组、EX527组、Dex+EX527组，每组10只。参照文献[7]构建小鼠UC模型，即将所有小鼠适应性喂养10天后，Ctrl组小鼠饮用蒸馏水，其余小鼠均连续7天饮用2.5%DSS溶液，每2 d更换一次DSS溶液。小鼠若出现血便、少食少动、反应迟钝、精神状态不佳等现象时表示造模成功[8]。造模过程中无小鼠死亡，造模完成1 h后，按照20µg/kg Dex剂量腹腔注射Dex组小鼠[9],Dex+EX527组小鼠按照20µg/kg Dex剂量注射后，再通过腹腔注射2 mg/kg EX527[10],Ctrl组和Model组分别给予等体积的生理盐水腹腔注射，每天1次，连续30 d。

在造模成功开始，于每天下午6:00记录各组小鼠体重、粪便性状及大便隐血情况；末次给药12 h后，用戊巴比妥钠麻醉小鼠并打开腹腔，经腹主动脉取血后，取肛门至盲肠段结肠，一部分结肠固定在4%多聚甲醛中，另一部分储存在液氮中，用于后续实验。

1.2.2小鼠疾病活动指数（Disease activity index,DAI）评分

在造模成功开始，于每天下午6:00记录各组小鼠体重、粪便性状及大便隐血情况。评分标准参照文献[11]进行：体质量下降百分数（未下降为0分，1%～5%为1分，5%～10%为2分，10%～15%为3分，>15%为4分）；粪便性状指数（正常为0分，粪便松散不成形为2分，水样便为4分）；大便隐血情况（大便隐血实验阴性为0分，隐血阳性为2分，显性出血为4分）。DAI=（体重下降百分数评分+粪便性状指数评分+大便隐血评分）/3。

1.2.3 苏木精⁃伊红（HE）染色

将结肠组织固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋并切片（4µm），行HE染色，光学显微镜下观察结肠组织病理变化。

1.2.4 ELISA检测各组小鼠血清中TNF⁃α、IL⁃6的水平

用戊巴比妥钠麻醉小鼠并打开腹腔，经腹主动脉取血后，于室温下静置30 min，然后在4℃下以5 000 rpm离心20 min，收集各组小鼠血清，ELISA法检测血清TNF⁃α、IL⁃6水平。

1.2.5各组小鼠肠黏膜组织中SOD及MDA含量的检测

严格参照MDA、SOD试剂盒说明书步骤进行操作，检测各组小鼠肠黏膜组织中SOD及MDA含量。

1.2.6 TUNEL检测各组小鼠肠黏膜细胞凋亡

使用4%多聚甲醛固定冰冻切片，然后用PBS清洗冰冻切片2次，将含有0.3%Triton X⁃100的PBS添加到冷冻切片中。最后加入50µL TUNEL溶液染色，细胞核呈棕黄色的细胞为凋亡阳性细胞。用荧光显微镜检测随机挑选6个视野进行观察。细胞凋亡率=阳性细胞/总细胞数。

1.2.7 Western blot检测各组小鼠肠黏膜中Sirt1、PGC⁃1α蛋白表达

提取肠黏膜组织总蛋白，定量蛋白浓度后，用12%SDS⁃PAGE分离并转膜，将膜封闭1 h,PBST洗涤3次。4℃下与一抗Sirt1(1∶2 000）、PGC⁃1α(1∶1 000）、GAPDH(1∶1 000）孵育过夜，室温下二抗（1∶3000）孵育1h，显影。Image软件分析条带灰度值。

1.3统计分析

SPSS 20.0软件用于统计分析，计量资料用均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析和SNK⁃q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组小鼠DAI评分比较

Ctrl组小鼠粪便性状正常，大便隐血实验为阴性；Model组小鼠构模2 d后出现粪便松散不成形，构模3 d后逐渐出现大便隐血、水样便、体质量逐渐下降，DAI评分明显高于Ctrl组；给予Dex处理后，小鼠大便隐血、水样便程度较Model组有所减轻，体质量降低，DAI评分降低；与Model组比较，EX527组小鼠大便隐血、水样便程度加剧，体质量降低，DAI评分显著升高；与Dex组比较，Dex+EX527组小鼠大便隐血程度降低，体质量升高，DAI评分显著升高（P<0.05）（表1）。

表1 各组小鼠DAI评分及血清TNF⁃α、IL⁃6比较

注：*与对照组相比，*P<0.05；#与模型组比较，#P<0.05；△与Dex组相比，△P<0.05；☆与EX527组相比，☆P<0.05

2.2各组小鼠肠黏膜损伤比较

HE染色结果显示，Ctrl组小鼠肠黏膜呈正常的形态；Model组出现黏膜上皮细胞变性、坏死、炎症细胞浸润、肠黏膜明显充血、水肿等病理改变；与Model组比较，Dex处理能明显改善UC小鼠肠道肠黏膜损伤，而加入EX527干预后，UC小鼠肠道肠黏膜损伤又加剧；与Dex组比较，Dex+EX527组UC小鼠肠道肠黏膜损伤严重（图1）。

图1 5组UC小鼠肠道肠黏膜损伤情况（HE染色,×100)

2.3 各组小鼠血清中TNF⁃α、IL⁃6水平比较

与Ctrl组比较，Model组血清TNF⁃α、IL⁃6水平升高（P<0.05）；与Model组比较，Dex组上述指标降低，EX527组上述指标升高（P<0.05）；与Dex组比较，Dex+EX527组上述指标升高（P<0.05）（表1）。

2.4各组小鼠肠黏膜组织中SOD及MDA含量比较

与Ctrl组比较，Model组小鼠肠黏膜组织中SOD活性降低，MDA含量升高（P<0.05）；与Model组比较，Dex组小鼠肠黏膜组织中SOD活性升高，MDA含量降低，而EX527组小鼠肠黏膜组织中SOD活性降低，MDA含量升高（P<0.05）；与Dex组比较，Dex+EX527组小鼠肠黏膜组织中SOD活性降低，MDA含量升高（P<0.05）（表2）。

表2各组小鼠肠黏膜组织中SOD活性、MDA含量及细胞凋亡率比较

2.5各组小鼠肠黏膜细胞凋亡率的比较

Ctrl组小肠黏膜绒毛附近可见少数凋亡阳性细胞；Model组小肠黏膜隐窝内可见大量凋亡细胞；与Model组比较，Dex组小肠黏膜隐窝内细胞凋亡率明显降低，EX527组小鼠肠黏膜细胞凋亡率显著升高（P<0.05）；与Dex组比较，Dex+EX527组小鼠肠黏膜细胞凋亡率显著升高（P<0.05）（图2和表2）。

2.6 各组小鼠肠黏膜组织中Sirt1、PGC⁃1α蛋白表达比较

与Ctrl组比较，Model组Sirt1、PGC⁃1α蛋白水平降低（P<0.05）；与Model组比较，Dex组上述蛋白水平升高，EX527组上述蛋白水平降低（P<0.05）；与Dex组比较，Dex+EX527组上述蛋白水平降低（P<0.05）（图3）。

3、讨论

UC是是常见的消化系统疾病，对直肠和结肠有害。近年来，UC的发病率呈上升趋势并趋于年轻化[12]，但其病因和发病机制尚未完全阐明。本研究通过利用2.5%DSS溶液连续7 d以诱导小鼠UC模型，结果显示，与Ctrl组比较，Model组小鼠出现黏膜上皮细胞变性、坏死、炎症细胞浸润、肠黏膜明显充血、水肿等病理改变，同时还发现DAI评分、血清中TNF⁃α、IL⁃6水平、MDA含量、细胞凋亡率显著升高，SOD活性显著降低，再次验证了小鼠UC模型构建成功。

图2 5组UC小鼠肠黏膜细胞凋亡情况（TUNEL染色，×200)

图3 Western blot检测5组小鼠胸黏膜组织中Sirt1、PGC-1α蛋白表达

Dex具有镇痛作用，在临床上常用于使患者保持镇静和麻醉状态的药物[13]。其已被证明在抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡方面发挥重要的作用[14-15]。杨毅等[16]发现Dex可抑制炎症和氧化应激，保护肝损伤小鼠的肝功能；张琦等[17]报道Dex可抑制颅脑损伤大鼠海马神经细胞的凋亡，该机制与其抑制Omi/HtrA2通路及凋亡相关蛋白的表达有关；Huang等[18]阐述Dex能减弱大鼠严重急性胰腺炎引起的全身炎症反应和局部胰腺损伤。本研究结果表明，与Model组比较，Dex处理能明显改善UC小鼠肠道肠黏膜损伤，此外，Dex能使UC小鼠DAI评分、血清中TNF⁃α、IL⁃6的水平、MDA含量、细胞凋亡率显著降低，SOD活性显著升高，提示Dex处理可减轻UC小鼠肠道肠黏膜损伤。

Sirt1是各种细胞功能和应激反应的关键调节因子，可通过与PGC⁃1α相互作用，参与许多生理过程，如抑制炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等[19]。据报道，激活Sirt1/PGC⁃1α可降低氧化应激和炎症反应，改善急性胰腺炎大鼠肝组织损伤[20]；且通过激活Sirt1/PGC⁃1α通路可改善线粒体功能，抑制炎症和氧化应激，减轻UC[21]。本研究中，Western blot结果显示Model组小鼠肠黏膜组织中Sirt1、PGC⁃1α蛋白表达水平显著低于Ctrl组，而加入Dex处理后，Sirt1、PGC⁃1α蛋白表达较Model组明显升高，UC小鼠肠道肠黏膜损伤减轻，提示Dex可能通过促进Sirt1、PGC⁃1α蛋白表达来发挥对UC小鼠肠道肠黏膜损伤的保护作用。在此基础上，本研究在Dex处理后给予Sirt1信号通路抑制剂EX527进行干预，结果显示，Sirt1、PGC⁃1α蛋白表达降低，UC小鼠肠道肠黏膜损伤较Dex组有所加重，与Dex组比较，UC小鼠DAI评分、血清中TNF⁃α、IL⁃6的水平、MDA含量、细胞凋亡率显著升高，SOD活性显著降低，提示EX527可以逆转Dex对UC小鼠肠道肠黏膜损伤的保护作用，表明Dex对UC小鼠肠道肠黏膜损伤的保护作用与Sirt1信号通路有关。

综上所述，Dex可能通过激活Sirt1信号通路的激活，降低UC小鼠炎症反应，对UC小鼠肠道肠黏膜损伤起保护作用。但是Dex对肠黏膜损伤起保护作用可能还涉及其他通路，尚需后续深入研究。

参考文献:

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[11]陈韵之,田蕾.秦皮甲素对溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜的改善作用[J].中成药,2020, 42(5):1324-1328.

基金资助:上海市科技计划项目(21ZR1457300); 浦东新区卫健委学科建设项目(PWZzk2022-13);

文章来源:钱志伟,李立冬,夏建华,等.右美托咪定通过Sirt1信号通路对溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜损伤的影响[J].解剖学研究,2025,47(01):5-10.