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穿心莲内酯调节KEAP1/Nrf2信号通路对H2O2诱导软骨细胞损伤的影响

2025-02-10 111 上传者：管理员

摘要：目的探讨穿心莲内酯调节Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白（KEAP）1/核转录因子E2相关因子（Nrf）2信号通路对过氧化氢（H2O2）诱导的软骨细胞损伤的影响。方法将C-28/I2细胞分为对照组、模型组（100μmol H2O2）、穿心莲内酯低剂量组（100μmol H2O2+0.625μg/ml穿心莲内酯）、穿心莲内酯中剂量组（100μmol H2O2+1.250μg/ml穿心莲内酯）、穿心莲内酯高剂量组（100μmol H2O2+2.500μg/ml穿心莲内酯）。MTT法检测C-28/I2细胞增殖；流式细胞术检测C-28/I2细胞凋亡；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测C-28/I2细胞上清中肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6水平；试剂盒检测C-28/I2细胞中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量；实时荧光定量-聚合酶链反应（qRT-PCR）、Western印迹分别检测C-28/I2细胞中增殖核蛋白（PCNA）、B细胞淋巴瘤（Bcl）-2相关X蛋白（Bax）、KEAP1、Nrf2 mRNA及蛋白表达。结果与对照组比较，模型组OD546 nm值、GSH-Px、SOD活性、PCNA、Nrf2 mRNA及蛋白表达降低，细胞凋亡率、TNF-α、IL-6水平、MDA含量、KEAP1、Bax mRNA及蛋白表达升高，差异显著（P<0.05）;与模型组比较，穿心莲内酯低、中、高剂量组OD546值、GSH-Px、SOD活性、PCNA、Nrf2 mRNA及蛋白表达升高，细胞凋亡率、TNF-α、IL-6水平、MDA含量、KEAP1、Bax mRNA及蛋白表达降低，差异显著（P<0.05）。结论穿心莲内酯可减轻H2O2诱导的软骨细胞损伤，该机制可能与调控KEAP1/Nrf2信号通路有关。

关键词：
Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1/核转录因子E2相关因子2信号通路
氧化应激
穿心莲内酯
软骨细胞
过氧化氢
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骨关节炎以进行性软骨退化为特征，是老年人中最普遍的退行性关节疾病之一，可导致剧烈疼痛和关节功能障碍〔1〕。进行性软骨细胞凋亡是骨关节炎的主要致病特征〔2〕。有证据表明，一些氧化刺激物会诱导软骨细胞产生炎症介质，引起软骨稳态失衡，进而激活炎症反应，导致软骨细胞凋亡〔3～5〕。过氧化氢( H2O2 )是一种常见的氧化刺激物，可诱导线粒体损伤、脂质过氧化和DNA损伤，导致软骨细胞凋亡〔6〕。因此，抑制软骨细胞的氧化应激损伤可能成为骨关节炎的潜在治疗策略。穿心莲内酯是从穿心莲植物中分离出的天然产物，其具有广泛的生物活性，例如抗炎、免疫调节、抗病毒活性等〔7〕。据报道，穿心莲内酯通过促进软骨细胞增殖和抑制细胞凋亡发挥潜在的抗关节炎作用〔8〕，但具体机制尚不明确。相关研究表明，Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白( KEAP) 1 /核转录因子E2相关因子( Nrf) 2通路可调控H2O2诱导的氧化应激，进而对人骨关节炎软骨细胞发挥保护作用〔9〕，但穿心莲内酯对H2O2诱导的软骨细胞损伤的影响是否与KEAP1 /Nrf2信号通路有关尚不可知。因此，本研究主要探究穿心莲内酯对H2O2诱导的软骨细胞损伤的影响及可能的机制。

1、材料与方法

1. 1细胞来源

人软骨细胞系C-28 /I2细胞购自上海圻明生物科技有限公司。

1. 2主要试剂

穿心莲内酯(规格: 1 g)购自北京康瑞纳生物科技有限公司; H2O2购自上海鼎国生技股份有限公司，MTT试剂盒从北京索莱宝药业股份有限公司购得，上海复申生化技术公司购得膜联蛋白( Annexin)Ⅴ-异硫氰酸荧光素( FITC) /碘化丙啶( PI)双染色试剂盒。肿瘤坏死因子( TNF) -α 和白细胞介素( IL) -6酶联免疫吸附试验( ELISA)检测盒购自普健(武汉)陆隐无语。谷胱甘肽-过氧化物酶( GSH-Px)、超氧化物歧化酶( SOD)、丙二醛( MDA)从上海富雨生化技术有限公司购得试剂盒。兔源一抗增殖核蛋白( PCNA)、B细胞淋巴瘤( Bcl) -2相关X蛋白( Bax)、Nrf2均购自成都正能生物技术公司，KEAP1购自Affinity公司，由英国Abcam公司生产的GAPDH与辣根过氧化物酶( HＲP)耦联的山羊抗兔免疫球蛋白( Ig) G双抗型。

1. 3细胞培养及处理

在37℃，5% CO2培养箱中，利用含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基培养C-28 /I2细胞。对数生长期的C-28 /I2细胞随机分成组。模型组〔10〕C-28 /I2细胞用100μmol H2O2处理24 h;穿心莲内酯低、中、高剂量组〔11〕分别用0. 625、1. 250、2. 500μg /ml穿心莲内酯处理，同时加入100μmol H2O2共同处理24 h;另取正常培养的C-28 /I2细胞作为对照组。治疗完成后，采集每一组的细胞或上清供下一步试验使用。

1. 4 MTT法检测C-28 /I2细胞增殖

将各组C-28 /I2细胞以1×104个/孔的密度接种在96孔板中，加入50μl MTT试剂后在37℃ 下孵育3 h。孵育后，将150μl二甲基亚砜添加到每个孔中，并在摇床上混合15 min。利用酶标仪检测546 nm的光密度( OD)。

1. 5流式细胞术检测

C-28 /I2细胞凋亡收集各组C-28 /I2细胞，利用结合缓冲液调整细胞浓度为5×105个/ml，取100μl细胞悬液，加入5μl AnnexinV-FITC和5μl PI在室温下避光孵育10 min。使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1. 6 ELISA检测

C-28 /I2细胞上清中TNF-α、IL-6水平按照ELISA试剂盒说明书步骤分析C-28 /I2细胞上清中TNF-α、IL-6水平。

1. 7试剂盒检测

C-28 /I2细胞中GSH-Px、SOD活性及MDA含量按照试剂盒说明书检测C-28 /I2细胞中GSH-Px、SOD活性及MDA含量。

1. 8实时荧光定量-聚合酶链反应( qＲT-PCＲ)检测

C-28 /I2细胞中PCNA、Bax、KEAP1、Nrf2 mＲNA表达采用TＲIzol法对C-28 /I2的细胞进行ＲNA的分离。将ＲNA反转录成cDNA后进行qＲT-PCＲ。目的基因的相对表达水平采用2－ΔΔCt方法计算。所用引物序列( 5'-3') : PCNA上游TTACCATAGAGATGAATGAACCA，下游AGTGTCACCGTTGAAGAG; Bax上游AAGAAGCTGAGCGAGTGT，下游GGCGGCAATCATCCTCTG; KEAP1上游ATGAACACCATCCGAAGCG，下游TGTATCTGGGTCGTAACACTCC; Nrf2上游TCAGTCAGCGACGGAAAG，下游TGGGC-AACCTGGGAGTAG; GAPDH上游TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG，下游TCAAAGGTGGAGGAGTGG-GT。

1. 9 Western印迹法测定

PCNA、Bax、KEAP1的表达采用ＲIPA缓冲剂，将Nrf2基因敲除。蛋白定量，电泳，转膜;密封，接着用单抗PCNA( 1∶1 000)、Bax( 1∶2 000)、Nrf2( 1∶2 000)、GAPDH( 1∶1 000)在4℃过夜孵育。随后，将膜与相应的HＲP耦联山羊抗兔IgG二抗( 1∶2 000)在37℃ 下孵育2 h。使用电化学发光试剂使蛋白质条带可视化。ImageJ软件进行蛋白光密度分析。

1. 10统计学分析

采用GraphPad Prism7软件进行SNK-q检检验。

2、结果

2. 1穿心莲内酯对C-28 /I2细胞增殖的影响

模型组大鼠C-28 /I2的OD546明显低于对照组( P＜0. 05) ;穿心莲内酯低、中、高剂量组均显著优于模型组，穿心莲内酯各剂量组OD546值呈剂量依赖性( P＜0. 05)，见表1。

2. 2穿心莲内酯对C-28 /I2细胞中GSH-Px、SOD活性及MDA含量的影响

与对照组比较，模型组GSH-Px、SOD活性降低，MDA含量升高，差异显著( P＜0. 05) ;与模型组比较，穿心莲内酯低、中、高剂量组GSH-Px、SOD活性显著升高，MDA含量显著降低，且呈剂量依赖性( P＜0. 05)，见表1。

2. 3穿心莲内酯对C-28 /I2细胞凋亡的影响

模型组C-28 /I2的凋亡明显高于对照组( P＜0. 05) ;穿心莲内酯低、中、高剂量组凋亡率显著低于模型组( P＜0. 05)，且穿心莲内酯各剂量组细胞凋亡率呈剂·684· 中国老年学杂志2025年2月第45卷量依赖性( P＜0. 05)，见表1、图1。

表1各组C-28 /I2细胞增殖能力、凋亡率、GSH-Px、SOD活性及MDA含量比较

图1流式细胞术检测各组C-28 /I2细胞凋亡

2. 4穿心莲内酯对C-28 /I2细胞上清中TNF-α、IL6水平的影响与对照组比较，模型组TNF-α 和IL6的含量明显增高( P＜0. 05)。穿心莲内酯低、中、高剂量组TNF-α 和IL-6含量均较模型组显著下降，且呈剂量依赖性( P＜0. 05)。见表2。

表2各组C-28 /I2细胞上清中TNF-α、IL-6水平比较

2. 5穿心莲内酯对C-28 /I2细胞中PCNA、Bax、KEAP1、Nrf2 mＲNA及蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组C-28 /I2细胞中PCNA、Nrf2 mＲNA及蛋白表达降低，KEAP1、Bax mＲNA及蛋白表达升高，差异显著( P＜0. 05) ;与模型组比较，穿心莲内酯低、中、高剂量组PCNA、Nrf2 mＲNA及蛋白表达显著升高，KEAP1、Bax mＲNA及蛋白表达显著降低，且呈剂量依赖性( P＜0. 05)，见图2、表3。1～5:对照组，模型组，穿心莲内酯低、中、高剂量组

图2 Western印迹检测各组C-28 /I2细胞中PCNA、Bax、KEAP1、Nrf2蛋白

表3各组C-28 /I2细胞中PCNA、Bax、KEAP1、Nrf2 mＲNA和蛋白表达比较

3、讨论

有研究显示，与未处理的细胞相比，H2O2处理过的软骨细胞分泌更高水平的炎性因子IL-6、TNF-α〔12〕;清除MDA、促进细胞增殖并激活GSH-px和SOD可减轻白细胞介素1β 诱导的软骨细胞的氧化应激和细胞凋亡〔13〕。本研究结果表明，H2O2处理的C-28/I2细胞存在氧化应激、炎症反应及细胞凋亡。穿心莲内酯是一种从穿心莲中提取的二萜内酯，穿心莲内酯的治疗潜力，包括其抗炎、抗凋亡和免疫调节特性，引起了许多研究人员的关注〔14〕。如穿心莲内酯可抑制骨关节炎小鼠软骨细胞凋亡〔15〕;穿心莲内酯可通过促进炎性微环境中软骨细胞表型稳定，为治疗关节软骨缺损提供新思路〔16〕。以上研究表明，穿心莲内酯对骨关节炎软骨细胞具有保护作用。本研究显示，穿心莲内酯可抑制H2O2诱导的C-28 /I2细胞氧化应激、炎症反应及细胞凋亡，且呈剂量依赖性，提示穿心莲内酯可能成为治疗骨关节炎的潜在有效药物。Nrf2是氧化压力感受器，也是重要的转录因子。

当细胞处于过度氧化应激时，Nrf2可以与KEAP1解离并进入到细胞核中，Nrf2开始在细胞核中积累。随后，Nrf2与含有抗氧化反应元件的基因结合，这些基因起到减轻氧化损伤和维持细胞氧化还原稳态的作用〔17〕。据报道，抑制KEAP1，上调Nrf2可改善急性酒精性肝损伤小鼠氧化应激〔18〕;激活Nrf2，抑制KEAP1可抑制脂多糖诱导的肺泡上皮细胞氧化应激损伤和凋亡反应〔19〕;激活KEAP1 /Nrf2信号通路中Nrf2可减弱IL-1β 诱导的氧化应激并对软骨细胞发挥保护作用〔20〕。本研究结果表明，穿心莲内酯对H2O2诱导的C-28 /I2细胞氧化应激、炎症反应及细胞凋亡的抑制作用可能与调控KEAP1 /Nrf2信号通路有关。未进一步设置通路激活剂或抑制剂来验证穿心莲内酯作用的具体机制是本研究的不足之一，后期将会深入探究。综上所述，穿心莲内酯对H2O2诱导的C-28 /I2细胞氧化应激、炎症反应及细胞凋亡的抑制作用可能与调控KEAP1 /Nrf2信号通路有关。穿心莲内酯可能成为治疗骨关节炎的潜在有效药物，该研究可能为临床治疗骨关节炎提供实验依据。

参考文献:

16徐丽女,刘海蓉,戴瑶,等.载穿心莲内酯胶原缓释支架促进体外炎症环境下软骨细胞表型维持的研究〔J〕.生物医学工程学杂志,2018; 35( 6) : 905-13.

基金资助:贵州省科技计划项目(黔科合基础-ZK[2022]一般427);贵州省卫生健康委科学技术基金项目(gzwkj2021-244);

文章来源:方舟,李光第,余资江.穿心莲内酯调节KEAP1/Nrf2信号通路对H2O2诱导的软骨细胞损伤的影响[J].中国老年学杂志,2025,45(03):683-687.