淫羊藿苷(icariin, ICA)为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿等的干燥茎叶提取的一种黄酮类化合物，具备一定的抗肿瘤作用[1]。内质网(endoplasmic reticulum, ER)是真核细胞的重要细胞器，主要负责蛋白质的合成、分泌及降解，多种病理生理因素可破坏内质网稳态，引发蛋白质合成障碍，而错误折叠和未折叠的蛋白质在内质网腔内堆积，细胞为此将做出一系列的应激反应，即内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[2]。本文拟从ERS角度探讨ICA对人结肠癌细胞HCT116、SW620增殖和凋亡的影响。

1、材料与方法

1材料

细胞 人结肠癌细胞HCT116、SW620,均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

药品与试剂 淫羊藿苷，规格：每瓶1 g,批号：S231203,购自美国MCE(MedChemExpress)公司。胎牛血清、青霉素-链霉素、胰蛋白酶，购自美国Gibco公司；RPMI-1640培养基，购自美国Corning公司；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒，均购自日本同仁化学研究所；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)试剂盒，均购自江苏碧云天生物技术研究所；磷酸化真核翻译起始因子2α(phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2α,phospho-eif2α,p-eif2α)、真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eif2α)、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, perk)、胱天蛋白酶3(cysteine aspartic acid specific protease-3,caspase-3)、剪切的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3,c-cas3)、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax)及内参(β-actin),均购自美国Cell Signaling Technology公司；葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 kD,GRP78/Bip)抗体，购自英国Abcam公司；磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, p-perk),购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

仪器IX73倒置荧光显微镜，日本Olmypus公司产品；Varioskan LUX酶标仪，美国ThermoFisher Scientific公司产品；CytoFLEX流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司产品。

2实验方法

2.1药物处理

将淫羊藿苷单体粉末溶于二甲基亚砜中，配制成5 mmol·L-1的储存液，-80℃避光保存，用培养基稀释为需要的浓度，即用即配。

2.2细胞培养

从液氮中取出HCT116、SW620细胞，复苏后置于无菌培养瓶中培养。培养液为含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基，5%CO2恒温37℃箱培养，细胞长至80%～90%时可传代。

2.3以CCK-8法检测细胞活性[3]3]

将对数生长期的HCT116、SW620细胞接种于96孔板中，每孔5×103个细胞，设置6个重复，培养体系为每孔培养基100μL,贴壁后，更换为含不同浓度淫羊藿苷(0、25、50、100、150、200、300、400、600和800μmol·L-1)的培养基培养细胞，设定24、48和72 h测定时间点。当药物刺激时间到达24、48和72 h后，向每孔加入CCK-8工作液100μL,然后置于37℃培养箱中孵育30 min～4 h,用酶标仪在450 nm处检测每孔光密度(optical density, OD)值，计算淫羊藿苷作用于HCT116、SW620细胞的半数抑制浓度(median inhibitory concentration, IC50)。

2.4以平板细胞克隆实验检测细胞增殖情况[4]4]

将HCT116、SW620细胞接种于小皿或6孔板(每孔500个),24 h后，分别用0、25、50、100μmol·L-1淫羊藿苷处理HCT116细胞48 h,选取0、40、80、120μmol·L-1淫羊藿苷处理SW620细胞48 h随后更换为普通培养基继续培养约10 d,甲醛固定，结晶紫染色，用Image J统计菌落数量。

2.5以流式细胞学检测各组细胞凋亡情况[5]5]

根据CCK-8实验结果，选取接近48 h 1/2 IC50、IC50、2IC50的浓度进行细胞凋亡实验。取对数生长期的HCT116、SW620细胞接种于6孔板中，每孔1×106个细胞，培养体系为每孔培养基2 mL,贴壁后，加入0、55、110、220μmol·L-1 ICA处理HCT116细胞48 h,加入0、80、160、320μmol·L-1 ICA处理SW620细胞48 h。随后胰酶消化、清洗、重悬，加入Annexin V-FITC、PI抗体孵育，进行流式细胞学检测，每组实验重复3次。

2.6以蛋白质印迹(Western blot)法检测相关蛋白表达水平[6]6]

取对数生长期的HCT116、SW620细胞接种于6孔板中，每孔1×106个细胞，培养体系为每孔培养基2 mL,贴壁后，加入0、20、40、80μmol·L-1 ICA处理HCT116细胞48 h,加入0、25、50、100μmol·L-1 ICA处理SW620细胞48 h。随后提取蛋白，上样、电泳、转膜、孵育抗体，曝光显影。用Image J对条带进行灰度值定量分析，以内参为参照，分析各蛋白表达情况。

为了确切验证ICA处理能够诱导人结肠癌细胞HCT116、SW620内质网应激，加入了内质网应激抑制药4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid, 4-PBA)进行实验。将细胞分别分为对照组、ICA组和ICA+4-PBA组。待细胞贴壁后，对照组均用完全培养基培养HCT116、SW620细胞48 h; ICA组分别用80μmol·L-1、100μmol·L-1 ICA培养HCT116、SW620 48 h; ICA+4-PBA组分别用80μmol·L-1 ICA+2 mmol·L-1 4-PBA、100μmol·L-1 ICA+2 mmol·L-1 4-PBA培养HCT116、SW620 48 h。随后提取蛋白，用Western blot进行检测(方法同上)。

3统计学处理

所有的统计资料用GraphPad Pism 8统计分析软件进行分析。计量资料用x¯±s表示，多组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2、结 果

1 CCK-8法检测ICA对人结肠癌细胞HCT116、SW620的抑制作用

ICA对人结肠癌细胞HCT116、SW620生长的抑制作用，见图1。研究发现，随着ICA浓度的增加，对HCT116、SW620细胞的抑制作用也在逐渐增强，HCT116细胞24、48、72 h的IC50值分别为194.10、111.10、91.58μmol·L-1,SW620细胞24、48、72 h的IC50值分别为192.20、159.40、133.20μmol·L-1。根据48 h IC50结果选取后续实验所需的ICA浓度。

图1细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测淫羊藿苷(ICA)对HCT116、SW620细胞存活率影响

2平板细胞克隆实验检测淫羊藿苷对人结肠癌细胞HCT116、SW620增殖的影响

在HCT116细胞中，0、25、50、100μmol·L-1 ICA组细胞克隆率分别为(84.93±4.61)%、(66.33±12.59)%、(55.67±4.82)%、(37.80±2.84)%,与ICA 0μmol·L-1比较，ICA 50μmol·L-1组、100μmol·L-1组HCT116细胞克隆数目减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

在SW620细胞中，0、40、80、120μmol·L-1 ICA组细胞克隆率分别为(91.13±1.82)%、(87.40±1.06)%、(74.20±7.62)%、(60.40±6.77)%,与0μmol·L-1 ICA组比较，ICA 80μmol·L-1组、120μmol·L-1组SW620细胞克隆数目明显减少(P<0.05)。

3淫羊藿苷对人结肠癌细胞HCT116、SW620凋亡的影响

随着ICA浓度的增加，HCT116细胞显著凋亡，0、55、110、220μmol·L-1 ICA组凋亡率分别为(6.70±3.19)%、(12.73±1.90)%、(31.71±3.30)%、(56.85±3.66)%(P<0.05)。SW620细胞的凋亡具有浓度依赖性，0、80、160、320μmol·L-1 ICA组凋亡率分别为(3.28±0.12)%、(10.27±0.77)%、(22.34±2.16)%、(50.35±2.17)%。

与各自0μmol·L-1ICA组比较，HCT116细胞中80μmol·L-1 ICA组和SW620 100μmol·L-1 ICA组蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义(均P<0.05),见表1。

4淫羊藿苷对人结肠癌细胞HCT116、SW620内质网应激相关通路的影响

在HCT116细胞中，与ICA 0μmol·L-1组比较，80μmol·L-1 ICA组的各类蛋白表达水平均有显著变化，差异均有统计学意义(P<0.05)。在SW620细胞中，与ICA 0μmol·L-1组比较，100μmol·L-1 ICA组中p-perk、Bip蛋白表达水平显著改变，差异均有统计学意义(均P<0.05),见表2。

加入4-PBA后，HCT116、SW620细胞内质网应激蛋白p-perk、Bip、p-eif2a蛋白呈现下降趋势，差异均有统计学意义(均P<0.05),见表3。

表1淫羊藿苷(ICA)对HCT116、SW620细胞凋亡相关蛋白表达的影响(x¯±s)

表2淫羊藿苷(ICA)对HCT116、SW620细胞内质网应激相关蛋白表达的影响

表3加入4-PBA之后，淫羊藿苷(ICA)对HCT116、SW620细胞内质网应激相关蛋白表达的影响

3、讨 论

淫羊藿苷由于具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化、阻滞肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞扩散、降低耐药性、改善免疫功能等作用受到研究者关注[7]。本实验通过体外使用淫羊藿苷处理人结肠癌细胞株HCT116、SW620,用CCK-8法检测发现，在一定浓度范围内，ICA对HCT116、SW620有明显抑制作用；平板细胞克隆实验发现，ICA可明显抑制HCT116、SW620细胞增殖；Annexin-V/PI流式细胞术检测发现，有大量凋亡细胞出现，并呈浓度依赖性；以及蛋白质印迹检测发现，ICA可以促进cleaved caspase3、Bax蛋白的表达，抑制caspase-3蛋白和Bcl-2。以上实验结果提示，淫羊藿苷能够抑制结肠癌细胞株HCT116、SW620的增殖，并促进其凋亡。

目前的研究认为，肿瘤细胞死亡途径主要有3种：细胞凋亡、细胞自噬和细胞坏死，其中细胞凋亡是目前最具特征性的程序性细胞死亡形式，该信号通路主要包含内源性途径(线粒体凋亡途径)、外源性途径(死亡受体介导的途径)和内质网应激途径[8]。ERS是与许多肿瘤的发生关系密切的新型细胞凋亡途径。实验提示淫羊藿苷能够促进HCT116、SW620细胞的凋亡，并且，在ERS相关蛋白质印迹检测发现，淫羊藿苷可以促进p-eif2a、Bip、p-perk蛋白表达，抑制eif2a、perk蛋白，并呈剂量依赖性。随后加入内质网应激抑制剂4-PBA的蛋白质印迹发现，4-PBA可以抑制ICA诱导的内质网应激相关蛋白的表达。因此，本研究发现，淫羊藿苷可以通过内质网应激途径诱导HCT116、SW620的凋亡。

淫羊藿苷可通过激活内质网应激，上调p-perk、p-eif2α、Bip蛋白表达水平，诱导HCT116、SW620细胞凋亡。本实验为淫羊藿苷治疗结直肠癌提供了一定的实验基础，为淫羊藿苷的临床应用提供了理论的依据。

参考文献:

[3]汪玉倩,徐可,詹月萍,等.华蟾素对转化生长因子-β1诱导肝星状细胞激活的作用及机制研究[J].中国临床药理学杂志,2022,38(13):1452-1456.

[4]顾丽,张彩虹,杨丽,等.微小RNA-646对T47D和MCF-7乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响[J].中国临床药理学杂志,2022,38(16):1882-1886.

[5]张晓兰,莫殿军,刘艳茹,等.木犀草素对顺铂诱导乳腺癌细胞凋亡的增敏作用[J].中国临床药理学杂志,2022,38(14):1603-1606,1638.

[6]李可阳,龚丹丹,沈增强,等.阿德福韦酯下调HOXB7介导乙型病毒性肝炎相关肝癌细胞的增殖和凋亡[J].中国临床药理学杂志,2022,38(16):1897-1901.

[7]赵靖昌,丛超,赵莉,等.淫羊藿苷抗恶性肿瘤作用机制的研究进展[J].江苏中医药,2022,54(5):81-85.

[8] 张晨晨,袁喜先,陈丹妮.内质网应激及其在结直肠癌中作用的研究进展[J].癌症进展,2022,20(19):1963-1965,1969.

基金资助:国家科技部重点研发计划基金资助项目(2019YFC1316003);国家自然科学基金面上基金资助项目(81973625);上海市普陀区卫生健康系统临床特色专病建设基金资助项目(2019tszb01);

文章来源:王璐,王杰,陈腾等.淫羊藿苷激活内质网应激对人结肠癌细胞的凋亡作用[J].中国临床药理学杂志,2023,39(21):3106-3110.