宫颈癌是临床常见女性生殖系统恶性肿瘤,其发病率及死亡率逐年增加已严重影响女性患者生活质量甚至威胁生命安全,目前临床主要采用手术结合放疗或化疗等手段治疗,由于宫颈癌发病较为隐匿导致患者确诊时已处于中晚期,放疗则成为其主要治疗手段,但大部分患者存在放射抵抗及不良反应较大等问题导致治疗效果不佳[1]。故而探寻新型治疗药物从而提高宫颈癌患者生存率具有重要意义。他汀类药物具有抑制癌细胞增殖、细胞迁移及促使细胞凋亡作用,王军杰等[2]研究表明他汀类药物可通过抑制Akt信号通路进而抑制急性T淋巴细胞白血病细胞增殖并促使其凋亡。金迎迎等[3]研究表明辛伐他汀(simvastatin,SVA)可增强食管癌细胞的放疗敏感性。关于SVA对宫颈癌细胞放疗敏感性的影响尚未可知。细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase 1,Chk1)可在宫颈癌等多种恶性肿瘤组织中呈高表达,并可促进肿瘤细胞增殖及迁移。研究显示沉默Chk1基因可明显抑制宫颈癌细胞增殖,但关于其具体作用机制尚未完全阐明[4]。孙冬岩等[5]研究表明沉默Chk1基因可抑制卵巢癌细胞增殖并促进细胞凋亡,同时可增强卵巢癌细胞对放疗的敏感性。因此,本研究选取宫颈癌Hela细胞并给予SVA处理,分析SVA对Hela细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的影响并初步探讨其是否通过调控Chk1基因而发挥作用,以期为临床靶向治疗宫颈癌提供理论依据。

1、材料与方法

1.1实验细胞与主要试剂

人宫颈癌细胞株Hela购自中国科学院上海细胞研究所。SVA购自美国Sigma公司;DMEM培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清购自杭州仟诺生物科技有限公司;胰蛋白酶消化液购自北京索莱宝生物科技有限公司;噻唑蓝(MTT)与二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司;Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒购自上海复申生物科技有限公司;Chk1 siRNA(si-Chk1)、阴性对照siRNA( si-NC)、pcDNA3.1过表达质粒及空载体对照质粒均购自上海吉玛制药技术公司;Lipofectamine 2000脂质体购自上海润成生物科技有限公司;RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR premix Ex TaqTM(2×)试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司;兔抗鼠Chk1多克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗均购自美国CST公司;BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司;ECL显色试剂盒购自上海生物工程股份有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及照射条件

采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养宫颈癌Hela细胞,细胞放入孵育箱内培养,培养条件:温度37℃、5%CO2相对饱和湿度,3 d传代一次,收集对数生长期细胞进行后续实验。采用德国西门子直线加速器6 MV X射线 照射细胞,照射剂量分别为2、4、6、8 Gy,吸收剂量为600 cGy/min,射距为100 cm。

1.2.2 MTT法检测SVA对细胞增殖的抑制作用

收集对数生长期Hela细胞,接种于96孔培养板,调整细胞浓度为5×104个/孔,4℃冰箱内孵育过夜,次日每孔分别加入浓度为3.25μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L SVA,另以0μmol/L SVA为空白组(Con组)[6]。分别于培养24 h、48 h、72 h后加入20μl浓度为5 mg/ml的MTT溶液,继续培养4 h,弃培养基,分别加入DMSO溶液(150μl),置于酶标仪上检测各孔在波长为570 nm处吸光度值(A),细胞增殖抑制率=(A空白组-A给药组)/A空白组×100%。根据检测结果筛选Hela细胞增殖抑制率约为50%时SVA浓度并以此浓度为SVA组用于后续研究。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡率

用“1.2.2”中筛选的SVA浓度处理Hela细胞48 h,采用0.25%胰酶消化,置于2 000 r/min转速离心机离心5 min,收集细胞放入离心管内(1×106个细胞),预冷PBS冲洗细胞,加入500μl binding buffer重悬细胞,分别加入5μl Annexin V-FITC与PI,室温避光孵育5 min,上机检测,计算细胞凋亡率,凋亡率=(早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞)/细胞总数×100%。

1.2.4细胞转染

取对数生长期Hela细胞,转染前1 h将培养液替换为Opti-MEM减血清培养基,参照Lipofectamine 2000转染试剂盒进行转染,将Chk1阴性对照质粒、Chk1 siRNA分别转染至Hela细胞,分别命名为si-NC、si-Chk1组,转染后将其置于培养箱中(37℃、5%CO2)培养48 h,收集细胞备测。为了进一步验证SVA通过调控Chk1基因表达而发挥作用,根据Lipofectamine 2000转染试剂盒将重组pcDNA3.1/ Chk1基因过表达质粒及空载体对照质粒分别转染至SVA组细胞中,分别命名为SVA+pcDNA-Chk1组、SVA+pcDNA组。分别采用MTT法与流式细胞术检测各组细胞增殖抑制率及凋亡率。

1.2.5克隆形成实验

分别取各组处于对数生长期的Hela细胞,胰酶消化并接种于6孔板(200个细胞/孔),放入培养箱中(37℃、5%CO2)培养,24 h后分别采用2、4、6、8 Gy剂量照射Hela细胞,继续培养8～14 d,甲醇(95%)固定细胞,20 min后采用结晶紫染色,20 min后将细胞置于显微镜下观察细胞克隆个数,细胞接种效率=未照射细胞形成克隆数/接种细胞数,细胞存活分数=照射后细胞形成克隆数/(细胞接种数×接种效率),每组分别进行3次重复实验。

1.2.6实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Chk1 mRNA表达水平

收集各组Hela细胞,根据RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,参照反转录试剂盒将5μg RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板进行qRT-PCR反应。Chk1基因以GAPDH为内参基因,严格按照SYBR premix Ex TaqTM(2×)试剂盒说明书进行操作,置于ABI Fast 7500实时荧光定量PCR仪进行扩增反应,程序设置为94℃2 min,94℃30 s,56℃30 s,72℃30 s,共循环40次,每个样品均设置3个平行反应复孔,采用2-ΔΔCt法计算Chk1 mRNA相对表达量。

1.2.7蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Chk1蛋白表达水平

分别收集各组细胞并加入RIPA裂解液,提取细胞总蛋白,采用BCA法检测提取蛋白浓度,取40μg总蛋白分别加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶点样孔内以此分离蛋白,分离蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),5%脱脂奶粉封闭1 h,分别加入Chk1一抗(稀释比1∶500),4℃孵育过夜,TBST清洗,加入HRP标记的IgG二抗(稀释比1∶4 000),室温孵育2 h后进行ECL显影反应,应用Quantity One软件分析各条带灰度值,蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值。

1.3统计学方法

采用统计学软件SPSS 21.0进行分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析;计数资料采用χ2检验,各组数据均以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1不同浓度SVA对宫颈癌Hela细胞增殖抑制率的影响

用不同浓度SVA分别处理宫颈癌Hela细胞24 h、48 h、72 h,采用MTT法检测Hela细胞增殖抑制率,结果显示随着培养时间及SVA浓度的增加,Hela细胞增殖抑制率明显升高,且呈剂量依赖性,当作用时间为48 h、SVA浓度为12.5μmol/L时Hela细胞增殖抑制率约为50%,以此用作后续实验,见表1。

表1不同浓度SVA对宫颈癌Hela细胞增殖抑制率的影响

2.2 SVA对宫颈癌Hela细胞凋亡率的影响

用SVA(12.5μmol/L)处理Hela细胞48 h后,采用流式细胞术检测Hela细胞凋亡率,结果显示SVA组Hela细胞凋亡率显著高于Con组(P<0.05),表明SVA可促进Hela细胞凋亡,见图1及表2。

2.3 SVA对宫颈癌Hela细胞放疗敏感性的影响

用2、4、6、8 Gy剂量照射Hela细胞后,与Con组比较,SVA组Hela细胞存活分数明显降低(P<0.05),见图2。SVA组放射增敏比(SER)为1.771,表明SVA可增强Hela细胞放疗敏感性,放射生物学参数见表3。

表2 SVA对宫颈癌Hela细胞凋亡率的影响

图1细胞凋亡流式图

图2 SVA处理后不同剂量照射对宫颈癌Hela细胞存活分数的影响

表3 SVA处理后单击多靶模型参数

2.4 SVA对宫颈癌Hela细胞中Chk1基因表达的影响

用SVA(12.5μmol/L)处理Hela细胞48 h后,采用qRT-PCR和蛋白印迹实验分别检测宫颈癌Hela细胞中Chk1基因表达,与Con组相比,SVA处理Hela细胞48 h后可显著降低Chk1 mRNA及 蛋白的表达水平(P<0.05) ,见图3及表4。

图3 SVA处理后Chk1蛋白表达

2.5抑制Chk1表达对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、放疗敏感性的影响

采用蛋白印迹实验验证Chk1基因沉默效果,si-Chk1组Hela细胞中Chk1蛋白表达水平明显低于si-NC组(P<0.05),结果表明Hela细胞中Chk1基因沉默效果良好,见图4。进一步检测两组Hela细胞增殖抑制率及凋亡率,结果显示si-Chk1组Hela细胞增殖抑制 率及凋亡率均显著高于si-NC组(P<0.05),见表5。用2、4、6、8 Gy剂量照射两组Hela细胞,与si-NC组相比,si-Chk1组Hela细胞存活分数显著降低(P<0.05),见图5。SVA组SER为1.691,表明抑制Chk1表达可增强Hela细胞放疗敏感性,放射生物学参数见表6。

表4 SVA对宫颈癌Hela细胞中Chk1基 因表达的影响

图4抑制Chk1表达后Chk1蛋白水平

表5抑制Chk1表达对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡的影响

图5抑制Chk1表达后不同剂量照射对宫颈癌Hela细胞存活分数的影响

表6抑制Chk1表达后单击多靶模型参数

2.6过表达Chk1逆转了SVA对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡和放疗敏感性的影响

采用Western blot法验证Chk1基因过表达效果,与SVA+pcDNA组相比,SVA+pcDNA-Chk1组Hela细胞中Chk1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),表明Chk1基因过表达效果良好,见图6。进一步研究Chk1基因过表达对Hela细胞增殖、凋亡和放疗敏感性的影响,结果显示SVA+pcDNA-Chk1组Hela细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均显著低于SVA+pcDNA组(P<0.05),见表7。采用不同照射剂量处理后,随着照射剂量的增加SVA+pcDNA-Chk1组与SVA+pcDNA组Hela细胞存活分数均降低,SVA+pcDNA-Chk1组细胞存活分数明显高于SVA+pcDNA组(P<0.05),表明过表达Chk1逆转了SVA对宫颈癌Hela细胞放疗敏感性,见图7及表8。

图6过表达Chk1后Chk1蛋白水平

图7过表达Chk1后不同剂量照射对宫颈癌Hela细胞存活分数的影响

表7过表达Chk1逆转了SVA对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡的影响

表8过表达Chk1后单击多靶模型参数

3、讨论

放射治疗是宫颈癌患者的主要治疗手段之一,目前关于宫颈癌发生及发展的机制研究尚不清楚,导致其治疗效果不佳[7]。因而寻找与宫颈癌发生过程及其放疗疗效有关的分子标志物对提高宫颈癌患者放疗敏感性具有重要应用价值。近来研究发现他汀类药物可通过抑制甲羟戊酸合成进而发挥抗肿瘤功能并对提高放疗或化疗效果具有一定协同作用[8]。因此本研究进一步分析他汀类药物是否可以增强宫颈癌细胞对放疗的敏感性,可为宫颈癌治疗提供有效增敏靶向药物。

SVA作为洛伐他汀衍生药物,其可通过降低HMG-CoA还原酶活性进而参与蛋白质合成、细胞凋亡等生理病理过程,研究报道指出SVA可能通过诱导乳腺癌细胞周期阻滞进而抑制癌细胞增殖[9,10]。李娟等[11]研究发现SVA可通过调控低氧诱导因子表达进而抑制黑素瘤细胞增殖、迁移并促进细胞凋亡。刘建生等[12]研究表明SVA可通过增加肺癌细胞Caspase-3活性进而诱导细胞凋亡。本研究采用不同浓度SVA分别处理宫颈癌Hela细胞,并用MTT法检测Hela细胞增殖抑制率,结果显示随着培养时间及SVA浓度的增加Hela细胞增殖抑制率明显升高,且呈剂量依赖性,提示SVA可抑制宫颈癌细胞增殖。同时采用流式细胞术检测Hela细胞凋亡,结果显示SVA组Hela细胞凋亡率显著高于Con组,提示SVA可促进宫颈癌细胞凋亡,与上述SVA对其他肿瘤细胞的影响相似。研究表明小G蛋白Rho家族成员Rac1可通过降低内皮细胞对放疗的敏感性进而促进肿瘤细胞迁移,而他汀类药物又可通过降低Rac1活性进而抑制肿瘤细胞迁移[13]。另有研究显示洛伐他汀可能通过抑制Akt信号通路并激活AMPK信号通路进而增强肺癌细胞对放疗的敏感性[14]。本研究采用2、4、6、8 Gy剂量照射宫颈癌Hela细胞后,SVA组Hela细胞存活分数明显低于Con组,说明SVA可增强Hela细胞对放疗的敏感性,提示SVA可提高放疗杀伤宫颈癌细胞能力。SVA是否通过抑制或激活宫颈癌发生及发展相关信号通路进而发挥作用值得深入研究。

Chk1基因在膀胱癌细胞中呈高表达,沉默Chk1基因表达后可明显抑制膀胱癌细胞增殖并诱导细胞凋亡,研究报道指出二烯丙基二硫诱导胃癌细胞中沉默Chk1基因表达可明显增强细胞凋亡敏感性[15,16]。郭爱叶等[17]研究表明沉默Chk1基因可增强胃癌细胞对顺铂的敏感性。Chk1基因与肿瘤细胞增殖及细胞周期检测点密切相关,放疗或化疗作用下细胞周期检测点被激活进而引起细胞周期阻滞及细胞DNA损伤最终促使肿瘤细胞避免凋亡,但关于Chk1基因通过哪些信号通路发挥作用均需深入研究[18,19]。为了进一步探究SVA与Chk1基因的关系,本研究通过检测Con组与SVA组Hela细胞中Chk1基因表达水平,结果显示SVA组Hela细胞中Chk1 mRNA及蛋白表达水平均明显低于Con组,说明SVA可能通过降低Chk1表达进而发挥抗肿瘤作用。刘艳杰等[20]研究表明沉默Chk1基因表达可增强宫颈癌细胞对放疗的敏感性。本研究结果显示转染si-Chk1的宫颈癌Hela细胞中Chk1表达水平与细胞克隆能力明显降低,细胞增殖抑制率及凋亡率均明显升高,同时能够增强Hela细胞对放疗的敏感性。推测其可能作用机制为降低Chk1表达可降低细胞DNA损伤修复能力或引起细胞周期阻滞进而发挥增强Hela细胞放疗敏感性。为了进一步验证SVA是否通过调控Chk1基因而发挥作用,本研究通过构建Chk1过表达载体并转染至SVA组细胞中,结果显示SVA+pcDNA-Chk1组细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均明显降低,但其细胞存活分数明显高于SVA+pcDNA组,说明过表达Chk1逆转了SVA对宫颈癌Hela细胞放疗敏感性。提示SVA可能通过下调Chk1基因进而抑制Hela细胞增殖并促使其凋亡,同时可增强Hela细胞对放疗的敏感性。

综上所述,SVA可有效抑制宫颈癌Hela细胞增殖并诱导细胞凋亡,其可能通过下调Chk1基因进而增强Hela细胞放疗敏感性,可为放疗抗拒的宫颈癌患者治疗提供新思路,有助于改善宫颈癌患者放疗效果。

参考文献：

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基金:新疆维吾尔自治区自然科学基金(编号:2019D01C182)