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人参皂苷Rh1通过Wnt通路对肺腺癌A549细胞增殖的抑制机制研究

2020-08-05 308 上传者：管理员

摘要：目的:探讨人参皂苷Rh1通过Wnt通路抑制人肺腺癌A549细胞增殖的机制。方法:体外培养A549细胞,加入Rh1(5、10和20μmol/L)诱导后,采用MTT法检测A549细胞存活率,采用Western blot测定Wnt通路相关蛋白GSK-3β和β-catenin表达情况;利用β-catenin(S37A)慢病毒转染建立Wnt通路激活型A549细胞,进一步研究A549细胞中Wnt通路持续激活对Rh1抗增殖作用的影响。结果:Rh1可以剂量和时间依赖性地抑制A549细胞的增殖,同时Rh1可以剂量依赖性地显著降低A549细胞中的GSK-3β(Ser9)及β-catenin的表达水平。Wnt通路激活型的A549细胞部分抵消了Rh1的抗增殖作用。结论:Rh1可能通过抑制Wnt信号通路来抑制A549细胞的增殖。

关键词：
A549细胞
Wnt通路
人参皂苷Rh1
增殖
肺腺癌
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2019年国家癌症中心发表的《2015年中国恶性肿瘤流行情况分析》报告显示,在2015年全国主要恶性肿瘤发病率中,肺癌排在首位,仅2015年新发的肺癌患者就达78.8万人[1]。大约70%以上的肺癌患者被确诊时已经处于晚期,5年生存率不足15%[2]。因此,肺癌的防治工作显得尤其重要。近年来,从传统中药中发展抗肺癌药物成为了研究的热点。

人参长期被用于癌症的辅助治疗中,人参皂苷为其主要活性成分。多种人参皂苷单体均被证明具有显著的抗癌作用,如人参皂苷Rg1的抗卵巢癌作用[3]、人参皂苷Rh2的抗结肠癌作用[4]等。人参皂苷Rh1具有包括抗过敏、抗炎、抗衰老、抗肿瘤在内的多种药理作用[5]。有研究发现Rh1通过下调Bcl-2蛋白抑制宫颈癌细胞和人纤维肉瘤细胞的增殖[6,7],表明Rh1具有抑制癌细胞增殖的作用,但是具体的作用机制仍不明确,尤其对肺癌的抑制作用更是鲜有报道。Wnt/β-catenin信号通路对包括肺癌细胞在内的多种肿瘤细胞的增殖起着重要作用[8,9]。有研究表明人参皂苷Rh1具有抑制Wnt/β-catenin通路激活的作用[10]。GSK-3β是该通路的重要负向调节因子,当GSK-3β在Ser9位发生磷酸化时,GSK-3β的活性被抑制,导致Wnt/β-catenin通路的激活[11]。然而,Rh1是否能够通过抑制Wnt/β-catenin通路来抑制肺癌细胞的增殖尚不清楚。

为了研究上述问题,明确Rh1对肺癌细胞增殖的抑制作用及其可能的作用机制,本研究检测了Rh1对人肺腺癌A549细胞的增殖及Wnt/β-catenin信号通路的影响,并使用慢病毒转染技术激活了A549细胞中的Wnt/β-catenin通路,观察了其对Rh1抗增殖作用的影响。

1、材料与方法

1.1细胞

人肺腺癌A549细胞购自中国科学院(中国上海)典型培养物保藏中心。

1.2试剂和抗体

人参皂苷Rh1购于成都曼斯特生物科技有限公司(A0240),纯度≥97%;MTT、DMSO、β-actin抗体均购自sigma公司;p-GSK-3β(Ser9)、GSK-3β以及β-catenin抗体购自Cell Signaling Technology公司。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养

A549细胞在含有10%胎牛血清(FBS)和100μg/ml青霉素/链霉素的DMEM培养基中于37℃、5%CO2的环境中培养,细胞生长至约80%融合时用于实验。

1.3.2细胞存活率测定

对数生长期的A549细胞按照5 000个/孔的密度接种于96孔板,贴壁后分别加入Rh1(5、10和20μmol/L)诱导,药物刺激后从96孔板中吸出培养基,将MTT母液(5 mg/ml)按照1∶9的比例加入到培养基中混匀后每孔加入150μl,在37℃、5%CO2继续培养4 h后,用酶标仪检测490 nm处的光密度(OD)。

其中加入不同浓度药物诱导的细胞作为处理组,未加入药物诱导的细胞作为对照组,未加入细胞和药物的培养基作为空白组。细胞存活率处理组=(OD处理组-OD空白组)/(OD均值对照组-OD空白组)×100%。

1.3.3 Western blot检测相关蛋白表达

诱导后的细胞用冷PBS洗涤3次后,利用蛋白提取液缓冲液(Beyotime Institute of Biotechnology)以及蛋白酶抑制剂(Roche Applied Science)裂解A549细胞,12 000 r/min离心,收集上清液,利用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo)检测蛋白浓度。将样品总蛋白(30μg)加入10%SDS-PAGE胶上进行电泳并转膜到PVDF膜(Millipore)上。PVDF膜在5%脱脂奶粉封闭后分别与特异性的一抗[p- GSK-3β(Ser9)、GSK-3β和β-catenin,1∶1 000稀释]室温孵育2 h,PBS洗涤后,用对应的二抗室温孵育1 h后进行显色,蛋白条带图片用Image J软件进行分析计算相对灰度。实验中采用β-actin(1∶5 000稀释)作为参照蛋白。

1.3.4β-catenin(S37A)慢病毒载体的构建

为了进一步探讨Rh1的作用机制,通过过表达β-catenin(S37A)建立持续激活Wnt/β-catenin通路的A549细胞[12],委托山东维真生物科技有限公司进行了β-catenin(S37A)的慢病毒载体合成,同时构建了对照慢病毒载体。

1.3.5体外A549细胞转染效率的测定

A549细胞接种于24孔板,细胞融合达50%以上时进行慢病毒转染,弃培养基,加入不同转染复数(MOI)的慢病毒感染,同时加入6μg/ml聚凝胺,24 h后更换为完全培养基。病毒感染96 h后显微镜下观察,根据GFP荧光细胞表达情况评估病毒的感染效率,并用Western blot检测相关蛋白的沉默水平。

1.3.6检测β-catenin沉默对于细胞存活率的影响

将A549细胞分别转染siRNAβ-catenin慢病毒及siRNANC慢病毒后分组,分为A549+siRNANC组、A549+siRNANC+Rh1组、A549+siRNAβ-catenin组和A549+siRNAβ-catenin+Rh1组,转染48 h后加入Rh1药物继续诱导48 h,用MTT法检测细胞存活率。

1.4统计学方法

数据表示为均值±标准差,数据统计学分析使用SPSS 19.0软件,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行分析比较,方差齐性时采用LSD检验,方差不齐性时采用Welch检验进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Rh1抑制A549细胞增殖的效果

为了研究Rh1对A549细胞增殖的抑制作用,用Rh1处理A549细胞24 h,MTT检测细胞增殖程度。结果如图1A所示,Rh1(5、10和20μmol/L)可以剂量依赖性地显著降低A549细胞存活率(P<0.05)。用Rh1(10μmol/L)诱导A549细胞分别0、24、48、72、96和120 h,观察Rh1是否可以时间依赖性地抑制A549细胞增殖,结果如图1B所示,Rh1可以时间依赖性显著地降低A549细胞的存活率(P<0.05)。这些结果表明Rh1可以剂量和时间依赖性地显著抑制A549细胞增殖。

2.2 Rh1对A549细胞中Wnt/β-catenin通路激活的影响

如图2所示,与对照组相比,Rh1(5、10和20μmol/L)可以剂量依赖性地显著降低GSK-3β在Ser9位点的磷酸化水平(P<0.05),而不改变GSK-3β的总表达水平,显著的增加GSK-3β的活性,同时也可以剂量依赖性地显著降低 β-catenin的表达水平(P<0.05)。此结果表明,Rh1可以显著抑制A549肺癌细胞中Wnt/β-catenin通路的活化状态。

2.3慢病毒感染A549细胞体外感染效率的测定

重组慢病毒在A549细胞内感染率随着感染复数(MOI)的增大而逐渐增加。当MOI=5时,感染效率为40%;当MOI=10时,感染效率达到80%而无明显细胞中毒现象,所以本实验均采用MOI=10进行后续实验。Western blot检测β-catenin(S37A)慢病毒[Lvβ-catenin(S37A)]转染A549细胞的相关蛋白的表达,结果显示β-catenin(S37A)的表达量显著增加(P<0.01),为正常对照组的2.3倍,表明Wnt/β-catenin通路的活性被显著地激活了(图3)。

图1 Rh1抑制A549细胞增殖的效果

图2 Rh1剂量依赖性地抑制Wnt/β-catenin通路活性

图3慢病毒感染A549细胞体外感染效率的测定

2.4激活Wnt/β-catenin通路对Rh1抗A549细胞增殖的影响

使用LvNC或Lvβ-catenin(S37A)的慢病毒分别转染A549细胞48 h后,加入Rh1(10μmol/L)继续诱导48 h,进一步研究Wnt/β-catenin通路是否与Rh1的抗A549细胞增殖效果有关。如图4所示,与LvNC+Rh1(10μmol/L)处理组相比,Lvβ-catenin(S37A)+Rh1(10μmol/L)共同处理组显著的降低了抗A549细胞增殖效果,A549细胞存活率从63.15%增加至82.98%(P<0.01)。上述结果表明,Rh1对A549细胞增殖的抑制作用部分是由于抑制了Wnt/β-catenin通路的激活所导致的。

图4激活Wnt/β-catenin通路对Rh1抗A549细胞增殖的影响

3、讨论

本次研究探讨了人参皂苷Rh1抗人肺腺癌A549细胞增殖的作用及其机制,实验结果表明Rh1可以剂量和时间依赖性地抑制A549细胞的增殖。

影响肺癌细胞增殖的信号通路较多,Wnt/β-catenin通路被证明是影响肺癌细胞增殖的主要通路[13],然而Rh1对A549细胞中Wnt/β-catenin通路的作用尚不清楚。本研究发现,Rh1可以剂量依赖性地显著降低A549细胞中GSK-3β在Ser9位的磷酸化水平,并可以显著降低β-catenin的表达水平,表明Rh1可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路的活性来发挥抗A549细胞增殖作用的。另外,本研究中采用慢病毒转染技术,成功建立Wnt/β-catenin通路激活型的A549细胞,并在此基础上研究发现Rh1对肺癌细胞的抗增殖作用可以被激活Wnt/β-catenin通路而部分抵消, Wnt/β-catenin通路中的GSK-3β和β-catenin可能是Rh1的药理学作用靶点,同时提示Wnt/β-catenin通路的有效抑制剂可能是抗肺癌治疗的有效途径。此外,由于Wnt/β-catenin通路被发现在其他一系列病理过程及疾病的发展中也发挥着重要调节作用,包括糖尿病、炎症和脂肪酸代谢等都发现了Wnt/β-catenin的异常激活[14,15]。本次研究结果也提示,人参皂苷Rh1可能可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路对这些疾病及病理生理过程起调节作用,有待进一步的实验验证。

综上所述,本次研究证实了Rh1具有抗肺腺癌A549细胞增殖的活性,其机制可能是由于Rh1抑制了A549细胞中Wnt/β-catenin通路的激活。本研究结果进一步明确了Rh1抗癌的药理作用,为其临床用于抗癌治疗提供了理论支持。

参考文献：

[1]郑荣寿,孙可欣,张思维,等.2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J].中华肿瘤杂志,2019,41(1):19-28.

[3]刘丹,刘婷,赵乐,等.人参皂苷Rg1通过NF-κB阻断缺氧诱导卵巢癌SKOV3细胞EMT[J].中国妇幼健康研究,2017,28(3):273-275,278.

[4]石雪萍,李静,冉建华,等.人参皂苷Rh2调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路诱导人结肠癌细胞凋亡[J].中国药理学通报,2017,33(1):114-119.

[6]孙倩.人参皂苷Rh1诱导Hela和K562细胞凋亡[J].肿瘤药学,2011,1(5):434-438.

谭晖,李恩孝,李毅,吴胤瑛,董旭媛,董丹凤.人参皂苷Rh1通过Wnt通路抑制肺腺癌A549细胞增殖的机制探讨[J].现代肿瘤医学,2020,28(18):3134-3137.