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乳腺癌中应用外泌体的研究进展

2020-08-05 326 上传者：管理员

摘要：乳腺癌是一种异质性疾病，是成年女性最常见的恶性肿瘤，发病率较高，也是女性最常见的死亡原因之一[1]。目前，乳腺癌的扩张和进展机制尚未完全阐明，基因表观遗传突变、激素水平异常和环境刺激等，均是诱导乳腺癌发生的高危因素。因此，了解乳腺癌的发生机制及其发展过程，对于指导临床诊断和治疗是非常有必要的。外泌体是从正常细胞和肿瘤细胞中释放出来，且直径大小为50～100 nm的小胞外囊泡，是一种新的细胞间通讯途径。肿瘤细胞分泌的外泌体能够促进肿瘤自身的生长发育，许多乳腺癌细胞产生的外泌体在患者的血清或血浆中含量较多，可作为预后不良的一项指标。由于外泌体能够从大多数体液中分离出来，它们可为非侵入性的癌症提供一个诊断指导方法。除此之外，越来越多的证据表明，外泌体影响各种常用药物的作用。因此，通过外泌体了解乳腺癌的发生、发展过程以及二者相互作用有益于临床上乳腺癌的诊断和治疗。

关键词：
乳腺癌
发生机制
外泌体
异质性
高危因素
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1、乳腺癌

乳腺癌细胞易感通常与其抑癌基因，如BRCA1、BRCA2、KDR、PIK3Ca和P53的遗传突变状态有关。同时，过度肥胖、吸烟、饮酒等不良生活习惯以及缺乏体育锻炼也可诱发乳腺癌。乳腺癌细胞中可以表达多种受体，例如雌激素受体（ER）、人表皮生长因子受体2(HER2）、孕酮受体（PR）等，在治疗乳腺癌时，可以针对性的对其特异性受体进行治疗。但是，最近几年的临床医疗实践表明，此类治疗方法治愈率较低，这可能与在针对乳腺癌细胞受体特异性治疗时，癌细胞产生耐药性有关。在三阴性乳腺癌（TNBC)中，肿瘤细胞不表达上述受体，在目前的临床实践中无靶向治疗，这些原因都会导致预后不良。

2、外泌体

2.1外泌体的形成

内体是有膜包裹的囊泡结构，以细胞质为界，位于细胞质外侧称为初级小体；位于细胞质内侧则称为次级小体。内体内含有50～100 nm的腔内小泡，当内体质膜融合后，腔内小泡释放到细胞外，分泌到细胞外的腔内小泡则称为外泌体。实验证明，外泌体中含有多种RNA及蛋白质，多种类型的细胞在正常或是病理条件下均可以分泌外泌体，外泌体通过将特定的分子转移到受体细胞发挥一系列的生物学作用[2]。受体细胞直接融合或者吞噬外泌体后再与细胞膜间接融合，亦或与受体细胞表面的特异性受体结合后释放其携带的内容物，进而导致受体细胞遗传信息交换，代谢重组，并可在肿瘤微环境中介导细胞间通信，参与组织浸润、转移和血管生成，最终导致肿瘤微环境恶化。正常乳腺上皮细胞的外泌体也会抑制乳腺癌细胞外泌体的分泌，而外泌体分泌是以组织特异性的方式发生的，来自乳腺上皮细胞标记的外泌体会整合到肿瘤细胞中，提示了一种反馈控制的机制[3]。

2.2外泌体功能

外泌体通过排泄病毒DNA或受损的核DNA来维持细胞的稳态。如果外泌体分泌受到抑制，细胞内的氧化应激反应就会增强，STING分子被激活，干扰素诱导的免疫受到刺激。外泌体可以通过各种生物体液，如血液、唾液等，影响其来源细胞或者远处细胞的活动[4]。外泌体也可将miRNA传递到受体细胞中，使其作为内源性miRNA发挥作用，影响蛋白质的合成[5]。此外，外泌体还可以帮助肿瘤细胞逃避免疫监视，形成促血管生成信号，使肿瘤血管化。同时，外泌体还可将遗传信息，如miRNA从肿瘤细胞转移到邻近细胞[6]。外泌体可以被吸收并转移到宿主细胞内，从而调节受体细胞的活动。因此，外泌体使细胞具有调节局部微环境和向远端细胞传递分子信号的能力。外泌体信号还可以促进细胞间表型性状的转移。

3、外泌体与乳腺癌

3.1外泌体参与乳腺癌细胞凋亡、增殖和细胞周期进展

凋亡是指正常细胞在经过一定数量分裂后，进行程序性的死亡。乳腺癌细胞之所以数量多，本质上也是由于其细胞中的细胞周期短。在调控细胞周期的物质中，细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶起着非常重要的作用。有关研究分析了凋亡细胞分泌的细胞外囊泡（EVs）的作用以及这些细胞外囊泡通过激活一种称为“肿瘤再生生态位（ORN）”的代偿机制使肿瘤再生。在这个过程中，由凋亡细胞产生的EVs通过调节周围细胞的增殖程度来决定其良性与恶性。MiR-1246在癌症组织和正常组织都处于过表达状态。因此，此类miRNA若负载在一些恶性肿瘤细胞的外泌体中，会促进肿瘤细胞的增殖，并可增强它们的浸润程度和转移率[7]。

3.2外泌体参与血管的生成、缺氧

与周围正常细胞相比，肿瘤细胞具有更快的增殖速度，这就导致了血管对肿瘤供氧不足，恶性细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF），从而导致内皮细胞血管的生成。间充质干细胞（MSCs）可以分化为多种细胞类型，可迁移到肿瘤部位，并对其产生复杂的影响。与供体细胞相比，MSC衍生的外泌体表现出不同的蛋白质和RNA谱，这些囊泡可以被乳腺癌细胞内化。结果表明，MSC所分泌的外泌体可以显著下调肿瘤细胞VEGF的表达，从而抑制血管生成。此外，miR-16是一种已知的靶向VEGF的miRNA，在MSC衍生的外泌体中富集，它与MSC衍生的外泌体的抗血管生成作用有关。King等[8]证明外泌体中含有的miR-210可以促进血管的生成，同时当肿瘤细胞处于低氧条件下，其外泌体中的低氧特异性miR-210增加，在乳腺癌细胞中作为miR-210靶点的Ephrin-A3含量会在该外泌体的诱导下降低，通过上调VEGF的表达来促进血管的生成。Maji等[9]发现，在恶性乳腺细胞系MCF10CA1的外泌体中表面分子AnnexinA2含量更高。此外，MCF10CA1分泌的外泌体以组织纤溶酶原激活物（TPA）依赖的方式促进内皮细胞的迁移，从而导致血管生成。然而，并不是所有的外泌体都可以促进肿瘤血管的生成，人骨髓间充质干细胞分泌含有miR-100的外泌体，它能够下调乳腺癌细胞VEGF水平，从而抑制血管的生成[10]。

3.3外泌体参与乳腺癌的侵袭、转移

在肿瘤微环境中，肿瘤细胞与免疫细胞的细胞间交流在癌症的侵袭、转移的过程中有重要意义。乳腺癌的转移是乳腺癌患者死亡的主要原因，在转移过程中，恶性肿瘤多数通过血液到达远端部位，形成新的肿瘤。相关资料发现，癌相关成纤维细胞（CAFs）分泌的外泌体具有诱导癌细胞转移的能力。乳腺上皮细胞当暴露于应激条件下，如血清耗竭时，会分泌一系列能够刺激乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的外泌体。

3.4、外泌体可以影响乳腺癌的耐药性

在当前临床实践中，乳腺癌患者的死亡或病情复发最常见的原因之一是在治疗过程中乳腺癌细胞产生了耐药性，进而导致治疗效果不佳。在癌症的化疗过程中，癌细胞产生耐药性的主要机制是通过基因突变、药物泵出以及存活蛋白的过度表达而表现。Azmi等[11]指出，癌变细胞可能通过miRNA等的外泌体与邻近细胞进行沟通，这可能是在治疗过程中导致细胞出现耐药性的原因之一，这与Chen等[12]研究结果一致。CD133是癌症干细胞的标志，其表达与包括乳腺癌在内的多种实体肿瘤的不良预后和耐药性有关[13]。Shedden等[14]研究发现，较高的外泌体分泌率与药物从肿瘤细胞中排出有关，而药物从肿瘤细胞的排出可导致肿瘤细胞对药物的敏感性降低，使细胞产生耐药性。外泌体作为异质性细胞群体之间交流的中介物，在癌症发展过程中也可实现细胞之间耐药性的传播。也有研究发现，外泌体不仅保护了miRNA免受富含核糖核酸酶环境的影响，而且还可以通过转运来调节miRNA的活性。这种调节作用与生物活性分子的恒定穿梭有关。分子质量为170kDa的P-GP是一种由人MDR1基因产生的跨膜蛋白，P-GP具有ATP依赖性，可以排出药物底物以维持适当的细胞内药物水平。P-GP的过度表达可能是导致耐药的主要机制之一。外泌体通过直接从细胞中泵出药物，或将耐药蛋白如P-糖蛋白转移到细胞中，以及将耐药的非编码RNA传递到其他癌细胞或肿瘤相关细胞的方式来参与肿瘤细胞耐药性的形成。从耐药细胞中排出的外泌体发现表达高水平的P-GP，而从敏感细胞中排出的外泌体表达的P-GP的水平较低，这说明耐药细胞与敏感细胞之间，外泌体中的P-GP或许存在一种传递机制，而这种传递也可能是外泌体介导的耐药转移的一种机制[15]。与之相关，Chen等[16]也揭示了一种相似的可能性，即耐药的乳腺癌细胞可以通过释放外泌体将抗药性能力传递给敏感细胞，目前认为这种调节效应是由于特定的miRNA在细胞间转移引起的。外泌体可以通过旁分泌或自分泌的方式转移DNA、RNA和蛋白质[17]，这种细胞间的交流可以使细胞产生化疗耐药性。研究发现，从耐药TNBC的HCC 1806细胞系中分离出的外泌体能够诱导MCF10A乳腺细胞增殖并产生耐药性，也表明其耐药性可以通过外泌体在细胞间转移[18]。

3.5脂肪细胞衍生外泌体的作用

脂肪细胞是一种肿瘤微环境中易被忽视的成分，它是人类乳腺组织中最丰富的基质细胞。这些细胞位于恶性细胞的附近，在乳腺癌细胞中此类情况尤为明显。在肿瘤的情况下，脂肪细胞降低了肿瘤抑制激素脂联素的产生，增强了肿瘤激素瘦素和胰岛素样生长因子-1的产生。

4、外泌体与TNBC

4.1 TNBC

在所有类型的乳腺癌中，TNBC占15%～20%[19]，相比于其他类型的乳腺癌,更容易发生局部复发和远处转移，患者5年内存活率低，死亡率明显高于其他乳腺癌类型，给治疗带来极大不便[20]。

4.2外泌体介导的Let-7a通过下调c-Myc的表达对TNBC发生和转移起到抑制作用

c-Myc为多个信号通路的节点，参与调节细胞的生长发育，调控细胞周期和细胞恶性转化。同时，还能介导PI3K通路，将细胞信号传递到细胞核。有研究表明，c-Myc参与许多恶性肿瘤的发生、发展，c-Myc的表达增加在一定程度上可以表明预后不良，肿瘤更容易复发、转移。Let-7a是经研究发现存在于乳腺癌中的一种miRNA，可以调节原癌基因（如KRAS）和细胞周期相关基因（cyclinD1/2）的表达，在肿瘤生长中起着重要作用。但是，Let-7a在乳腺癌细胞中的表达较低[20]。Du等[21]证明在乳腺癌发展中的c-Myc促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭；Let-7a的过度表达抑制了乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而参与调控的miRNA通常存在于外泌体中，外泌体介导的Let-7a显著抑制乳腺癌细胞在体内的增殖和侵袭，为临床上对TNBC患者的治疗提供一条可人为对外泌体进行干预的临床新思路。

5、外泌体在乳腺癌的临床应用

5.1外泌体作为纳米载体在乳腺癌治疗中的应用

外泌体具有较高的血清稳定性、生物相容性和较低的免疫原性、毒性，易通过各种屏障，可作为纳米载体来传导药物。多柔比星包裹的外泌体可降低心脏毒性，减少对其他组织的不良反应，从而靶向增加了对乳腺癌细胞的细胞毒性作用。由于miR-142-3p和miR-150在乳腺癌干细胞中的高表达水平与致瘤能力有关，而间充质干细胞的外泌体能有效地降低乳腺癌细胞中的miR-142-3p和miR-150的表达水平。因此，间充质干细胞衍生的外泌体可以作为一种可行的纳米载体，将基于RNA的治疗药物传递到乳腺癌细胞中，进而有益于对乳腺癌患者的治疗。

5.2外泌体作为乳腺癌微创诊断方法

乳腺癌细胞外泌体中不同的miRNA水平使它们能够作为诊断和预测乳腺癌治疗结果的疾病生物标志物[22]。有数据表明，细胞外泌体携带致癌蛋白和miRNA，可能进一步适用于发现早期乳腺恶性肿瘤，以及描述肿瘤的发生和转移的情况。研究发现，外泌体的转录可以部分代表其来源细胞，利用这一特性，外泌体可以成为检测肿瘤特异性标记物的基础。还有其他具有某些被认为有诊断价值的生物标志物的外泌体，例如，癌胚抗原（CEA）和癌抗原15-3(CA15-3），两者在乳腺癌细胞的外泌体中的含量水平都较高。Khan等[23]研究发现，乳腺癌患者血清中的存活素水平明显高于正常组，说明存活素的含量水平也可以被认为对乳腺癌有早期诊断价值。此外，TNBC患者血浆中的外泌体miRNA信号与健康对照组有显著差异，也提示外泌体具有乳腺癌诊断的作用。这些外泌体中的miRNA还可以预测临床病理参数和病理完全缓解（pCR）。具体来说，在单变量（P=0.013）和多变量（P=0.018）模型中，外泌体中较高的miR-155水平在TNBC中预测pCR最显著[24]。外泌体miR-373也可用于TNBC的诊断，因为TNBC患者的表达水平明显高于健康对照（P=0.001）。MiR-373也与三阴性表型相关，并被发现具有下调雌激素受体表达的作用。

6、小结与展望

乳腺癌的传统治疗方法存在着较多的弊端，临床上对于外泌体的诊断应用程度相比于其他传统治疗手段相对较少。外泌体中含有的内容物可以从各个方面影响乳腺癌的发展以及患者的预后情况，对于研究肿瘤的发展进程、早期诊断都有指导意义。本文介绍了外泌体的功能以及其与乳腺癌之间的联系，还介绍了外泌体的相关临床应用，为今后的乳腺癌治疗，外泌体作为载体应用于免疫治疗提供了可能性。

参考文献：

[1]李昆临,于乐,刘欢,等.乳腺癌影像学诊断进展[J].济宁医学院学报,2019,42(5):315-320.

迟昊,李昆临,于乐,栾斌,史慧,刘欢.外泌体在乳腺癌的应用研究进展[J].中国冶金工业医学杂志,2020,37(04):389-391.

基金:国家自然科学基金(81802856);济宁医学院博士启动基金(2017JYQD14)