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提取及鉴定不同转移习性人鼻咽癌细胞株中外泌体的方法研究

2020-08-06 559 上传者：管理员

摘要：目的探索不同转移习性人鼻咽癌细胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和正常鼻咽上皮细胞NP69细胞外泌体的表达情况,为进一步研究鼻咽癌的诊断和治疗新方法提供一定的理论基础。方法在2018年5月—2019年6月期间,用Exosome提取试剂盒从SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69培养上清液分离出外泌体,使用透射电镜进行观察验证外泌体形态,BCA试剂盒测定外泌体蛋白的浓度,蛋白质印迹法(Western blotting)法进行外泌体特异性抗原分子CD63及筏蛋白-1的检测。结果 3种鼻咽癌细胞系和正常鼻咽上皮细胞上清液中均分离出泡状物,在透射电镜下呈椭圆形或者圆形的泡状物。SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69细胞系外泌体蛋白浓度分别为0.778、0.635、0.788、0.576μg/μL;且所有细胞系来源的外泌体经检测均表达特异性抗原分子CD63及筏蛋白-1。结论 3种鼻咽癌细胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和正常鼻咽上皮细胞NP69细胞均产生外泌体。

关键词：
外泌体
恶性肿瘤
细胞内涵体
鉴定
鼻咽肿瘤
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鼻咽癌是我国南方高发的恶性肿瘤,易复发及转移,严重危害人民的生命和健康。外泌体是一种起源于细胞内涵体的小囊泡。研究表明外泌体携带功能性蛋白、mRNA和miRNA到邻近和远处的靶细胞,调节其免疫功能,在血管生成,细胞增殖,肿瘤浸润和细胞间的信息交流中起着重要的作用[1,2]。外泌体可以被细胞通过内吞作用摄取,或识别细胞表面的特异性靶向细胞并与细胞的细胞膜融合,同时释放mRNA和miRNA等进入细胞质[3]。细胞来源的外泌体可通过改变肿瘤的微环境,释放自身携带的细胞因子等多种方式影响肿瘤的生长[4]。

本研究提取2018年5月—2019年6月期间鼻咽癌细胞来源的外泌体,深入丰富对外泌体在鼻咽癌细胞间相互作用及其内在机制的理解,为研究鼻咽癌的诊断和治疗新方法提供理论基础。

1、资料与方法

1.1资料来源

SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1细胞购于酶联生物公司;NP69细胞购于北纳生物公司;培养细胞Exosome提取试剂盒购于唯辉生物;RIPA细胞裂解液购于北京普利莱基因技术有限公司;BCA蛋白定量试剂盒购于康为世纪;Mouse Monoclonal Anti-GAPDH、辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)购于中杉金桥有限公司;Rabbit Monoclonal Anti-CD63、Rabbit Polyclonal Anti-flotillin购于Abcam。

1.2检测方法

1.2.1外泌体提取

收集2 mL细胞培养基;离心细胞培养基去除细胞和细胞碎片;转移2 mL清澈的上清液(无细胞的培养基)到新的玻璃管1并放于冰上;在玻璃管2中,按照下列顺序依次加入溶液,制备A/B/C混合液(现配现用);涡旋混匀2(0.75 mL A/B/C混合液)5～10 s混匀溶液;将管2中的0.75 mL A/B/C混合液添加到管1中;紧紧地盖住管1,剧烈涡旋30 s,在4℃静置20 min;混合液分为3层,用移液器小心吸取上层培养基层,然后丢弃,不要碰到中间的Exosome层;将管中的Exosome层转移到新的1.5 mL离心管中,5 000×g离心3 min。产生一个新的三层分离;移出并丢弃“上层培养基颜色层”。插入吸头直到管的底部将“底层无色液体”完全吸出,管中只保留“Exosome”;在室温下将管盖打开5～10 min晾干;加入约Exosome层4倍体积的1×PBS到管中。用移液器上下剧烈吹打40次使Exosome层重悬。在水平摇床上高速摇动管子10 min。5 000×g离心5 min,将上清液小心的转移到过滤柱中,不要碰到沉淀;将柱子在1 000×g离心5 min,收集所有流出的液体;流出的是分离后的纯Exosome。

1.2.2外泌体鉴定

1.2.2.1透射电镜观察形态

吸取10μL外泌体滴加到铜网上沉淀1 min,滤纸从边缘吸去悬液;用2%磷戊酸10μL滴加到铜网上沉淀1 min,滤纸从边缘处吸取浮液;常温干燥2 min,用透射电镜[型号Tecnai Spirit T12(FEI)]观察外泌体形态并拍摄电镜照片。

1.2.2.2外泌体蛋白定量检测

按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行操作,稀释BSA标准品,配置BCA工作液,采用试管检测法,将稀释好的BSA标准品和待测蛋白样品各5μL分别加到作好标记的试管中。向每个试管中各加入100μL BCA工作液,充分混匀,37℃水浴中孵育30 min,将各管冷却至室温,须在3～5 min内完成检测。用紫外分光光度计在OD 562下测定其数据,测定BSA标准品及每个样品的吸光值。绘制标准曲线,计算样品中的蛋白浓度。

1.2.2.3 Western blotting检测

提取外泌体蛋白,加入缓冲液,沸水煮5 min,置于-20℃保存。配置10%分离胶和5%浓缩胶,加入已经架好的制胶板中,缓慢加入至板的2/3位置,加入无水乙醇压胶,待分离胶凝固后,加入浓缩胶,并插上齿梳。等到浓缩胶完全凝固后,配置1×电泳液。将架子放入到电泳液里拔去齿梳,加入一定10μL的蛋白样品和Marker。用1×电泳液浸没胶板,开始电泳,60 V压缩蛋白,80 V分离蛋白(120 min)。当条带跑至胶板一半的时候配置1×转膜液,并预冷。根据预计条带的位置裁剪好PVDF膜(约1～2 cm),甲醇激活15 s。切好大小合适含有内参或目的条带的胶。放好“三明治”(海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵)。用1×转膜液将“三明治”浸没,用300 mA恒流转膜。用1×TBST配置3%的脱脂牛奶封闭液,封闭过夜。配置1抗稀释液,将PVDF膜孵育一抗3 h。洗膜,用1×TBST浸泡10 min后弃掉1×TBST,重复3次。配置2抗稀释液(1∶5 000稀释),将PVDF膜孵育二抗2 h。洗膜,用1×TBST浸泡10 min后弃掉1×TBST,重复3次。配置发光液,用发光液浸湿PVDF膜后放置于超高灵敏度化学发光成像系统样品放置区运行程序显影成像。

2、结果

2.1透射电镜检测结果

透射电镜下可见外泌体呈囊泡状,直径约40～150 nm,见图1。

2.2外泌体蛋白定量

采用试管检测法进行外泌体蛋白定量检测。用紫外分光光度计在OD 562下测定其数据,测定BSA标准品及每个样品的吸光值。绘制标准曲线,计算样品中的蛋白浓度,结果见表1。

2.3 Western blotting结果

用Western Blotting检测提取外泌体中的特异性标志物CD63和筏蛋白-1,结果显示细胞系所提取的外泌体中均存在CD63和筏蛋白-1表达(图2),证实收集获得的囊泡为外泌体。

3、讨论

外泌体是一种起源于细胞内涵体的小囊泡,其直径为40～100 nm,最初被认为是细胞的垃圾,随着研究的深入,外泌体的特性和功能逐渐被人们所发现和认识。研究表明外泌体携带功能性蛋白、mRNA和miRNA到邻近和远处的靶细胞,调节其免疫功能,在血管生成,细胞增殖,肿瘤浸润和细胞间的信息交流中起着重要的作用[1,2,5]。外泌体可以被细胞通过内吞作用摄取,或识别细胞表面的特异性靶向细胞并与细胞的细胞膜融合,同时释放mRNA和miRNA等进入细胞质[3]。细胞来源的外泌体可通过改变肿瘤的微环境,释放自身携带的细胞因子等多种方式影响肿瘤的生长[4]。

图1透射电镜下外泌体形态图

表1样品中外泌体蛋白浓度

众所周知,鼻咽癌与EB病毒关系密切相关。研究表明来源于EB病毒感染细胞的外泌体在EB病毒的潜伏感染和致病过程中可能扮演着重要角色[6]。譬如,有学者在EB病毒感染的鼻咽癌细胞系外泌体中检测到了丰富的膜潜伏蛋白LMP1[7,8]。LMP1阳性外泌体与EB病毒阴性细胞共培养可以促使细胞内吞这些囊泡,并且引起ERK和PI3/Akt信号通路的激活[9,10]。文献报道LMP1阳性外泌体能改变鼻咽癌细胞间粘附分子ICAM-1的表达水平,引起细胞表型的改变。LMP1通过外泌体促进鼻咽癌细胞成纤维细胞生长因子2(FGF-2)的分泌,外泌体中有活性的FGF-2可能促进鼻咽癌血管生长[11]。转录活性的缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)也可以通过外泌体的内吞和胞吐作用从LMP1阳性的鼻咽癌细胞中分泌出来,然后进入邻近细胞改变钙粘素的表达水平,从而促进上皮间质转化[12,13]。

图2外泌体中CD63和筏蛋白-1的Western blotting结果

鼻咽癌外泌体可能适合作为生物学标记物。肿瘤在生长过程中不断释放外泌体到周围环境中,此外外泌体能在4℃保存96 h,-70℃下可以保存更长时间。外泌体的稳定性有利于临床通过检测血清,尿液或者唾液等体液中外泌体相关分子的改变,对疾病进行诊断和监测[14]。更重要的是,鼻咽癌外泌体具有高含量HLA-II分子,使用抗HLA-II的磁珠捕获可以有效特异采集鼻咽癌患者血浆中的外泌体,从而使得相同的实验条件下对照血浆样品中不会有外泌体捕获。已有研究报道鼻咽癌患者血浆中能持续检测到肿瘤外泌体[15]。因此鼻咽癌外泌体具有肿瘤标记物的潜能,有可能应用于指导鼻咽癌的临床诊断、治疗和筛查。

本实验从SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69细胞株中均提取出了泡状物。SUNE-1-6-10B细胞株来源的泡状物有完整的包膜,其内电子致密物多,大小比较均一,直径在80 nm左右。SUNE-1细胞来源泡状物有完整的双层包膜,包膜光滑清晰,且泡状物内电子致密物较多,大小均一,直径约100 nm。随后通过Western blotting测定了外泌体表面标志物CD63和Flotillin-1的表达,证实SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69细胞来源的此种泡状物即为外泌体。另有研究显示[16]肿瘤细胞可分泌外泌体且肿瘤患者的外周血中可检测到较高表达的循环外泌体。外泌体可通过多种途径和方式促进肿瘤的发生、侵袭转移、耐药性、免疫逃逸[17,18,19]。利用这些特点,外泌体可被人为搭载靶向药物或治疗性基因等物质,或通过多种方式对其分泌和释放进行调控来治疗多种肿瘤。综上所述,本研究成功提取了鼻咽癌细胞来源的外泌体,为今后进一步开展鼻咽癌外泌体相关的研究工作奠定了基础。

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基金:蚌埠医学院自然科学基金重点项目(BYKY1733ZD);蚌埠医学院转化医学重点专项项目(BYTM2019029);安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2019A0359)