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喉鳞状细胞癌发展中miR-630的调控机制研究

2020-08-21 301 上传者：管理员

摘要：目的：探讨miR-630在喉鳞状细胞癌（LSCC）发展中的调控机制。方法：从武汉科技大学附属孝感市中心医院耳鼻喉科收集获得24例临床LSCC标本和24例癌旁组织。体外培养正常人鼻咽细胞系hacat和人喉癌细胞系TU212，荧光定量PCR测定miR-630和下游靶标TP53INP2的表达情况。miR-630和下游靶标TP53INP2的相关性采用Pearson分析。采用特异性干扰miR-630的SiRNA转染TU212细胞，蛋白印迹监测TP53INP2蛋白表达情况。结果：与癌旁组织相比，LSCC组织中miR-630表达明显升高，差异有统计学意义（t=8.882,P<0.0001);TU212细胞中miR-630的表达明显高于hacat细胞，差异有统计学意义（t=8.303,P<0.0001）。Ⅲ、Ⅳ期癌组织中miR-630表达比Ⅰ、Ⅱ期癌组织明显升高，差异有统计学意义（t=2.336,P=0.029）。根据预测miR-630的靶基因为TP53INP2。TP53INP2在喉癌组织和细胞系中的表达均下调，差异有统计学意义（P<0.05）。在喉癌组织中TP53INP2的表达与miR-630呈负相关，差异有统计学意义（P<0.05）。在TU212细胞中转染SiRNA后，相对于对照组和NC组，miR-630的表达明显降低，TP53INP2的表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：miR-630在LSCC中过表达，与不良预后相关，通过负性调控TP53INP2从而促进肿瘤生长和转移。

关键词：
miR-630
TP53INP2
喉鳞状细胞癌
淋巴转移
病理分期
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喉癌是头颈部第二大流行的恶性肿瘤和第11位最常见的癌症，大多数喉癌是喉鳞状细胞癌（LSCC)[1]。过去十年，在治疗喉癌方面取得了重大进展，手术治疗、放射治疗和全身化疗等非手术选择已成为可靠有效的选择。但是患有早期疾病的患者症状通常缺乏明显特异性，大约60%的患者在诊断时为Ⅲ期或Ⅳ期[2]。临床上LSCC通常在晚期诊断并且在诊断后具有相对较差的存活率。因此，明确LSCC发生的机制和有效治疗靶点成为热点。

miRNA是22～25nt长度的小内源性非编码RNA家族，通过结合其靶mRNA的3‘-’UTR在转录后水平调节基因表达。越来越多的证据表明，miRNA在细胞增殖、分化和迁移中具有重要作用。miRNA的异常表达可能与各种类型的癌症有关[3,4]。miRNA-630被报道在卵巢癌和胃癌等多种恶性肿瘤中异常表达[5,6]，但喉癌中报道较少。本研究探讨miRNA-630在喉癌中的表达情况，并对miR-630表达量在喉癌发生和生存中的预测作用进行分析，为喉癌的诊断和治疗提供一个新的生物标记和靶点。

1、材料与方法

1.1材料

人喉癌细胞采用TU212细胞，对照采用hacat细胞[7]，均购自中科院上海细胞所。组织和细胞裂解液Trizol购自Invitrogen公司；miRcute增强型miRNAcDNA第一链合成试剂盒（货号kr211）和miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒（货号FP411）购自天根生化科技（北京）有限公司。引物序列通过北京擎科生物科技有限公司设计并合成。胎牛血清和RPMI-1640培养基购自浙江天杭生物科技股份有限公司。siRNA由广州市锐博生物科技有限公司提供。TP53INP2一抗购自北京博奥森生物技术有限公司（货号bs-17160R）。Lipofectamine2000Reagent试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2临床标本

从武汉科技大学附属孝感市中心医院耳鼻喉科喉癌手术中获得LSCC标本和癌旁组织标本各24例。喉癌分期按照美国癌症联合委员会第八版划分为Ⅰ期（T1N0M0）、Ⅱ期（T2N0M0）、Ⅲ期（T3N0M0,T1N1M0,T2N1M0,T3N1M0）、ⅣA期（T4aN0M0,T4aN1M0,T1N2M0,T2N2M0,T3N2M0,T4aN2M0）、ⅣB期（T4b和任何NM0，任何TN3M0）和ⅣC期（任何T任何NM1）。患者癌组织病理切片由医院病检科获得，采用奥林巴斯DP2-BSW显微镜拍照系统采图。本研究经本院伦理委员会批准，所有参与者均在本研究中签署了知情同意书。所有患者均未在手术前接受化疗或放疗。手术获得癌组织和癌旁组织标本，并储存在-80℃下进行下一步分析。

1.3细胞培养

TU212和hacat细胞培养在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养。细胞培养箱温度为37℃，含有5%CO2。细胞融合至80%时采用0.125%胰蛋白酶消化、传代[7,8]。

1.4实时荧光定量PCR

组织样本和细胞采用Trizol裂解后，用试剂盒逆转录反应，最终生成对应的cDNA第一链。qPCR反应体系为20μL体系。miR-630引物：上游5'-AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU-3'，下游5'-CUUCCCUGGUACAGAAUACUUU-3'，内参U6引物：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。TP53INP2引物：上游5'-CGGCTGGCTCATCATTGAC-3'，下游5'-CAGCTCTCGTCCATCAAGGA-3'，内参β-actin引物：上游5'-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3'，下游5'-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3'。荧光定量PCR系统为AppliedBiosystems®7300。

1.5质粒载体转染

采用NCE1细胞，实验分三组，对照组细胞不做处理，NC组转染空质粒，siRNA组采用Lipofectamine2000Reagent试剂盒将靶向干扰miR-630的siRNA转染到TU212细胞中。

1.6蛋白印迹

细胞蛋白用裂解缓冲液提取。使用BCA蛋白测定试剂盒定量蛋白浓度。蛋白样品用5%SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转移到PFA膜。将膜与一抗（1∶1000稀释）在4℃孵育12h，随后与二抗在室温孵育1.5h。采用凝胶成像仪采集图像。使用QuantityOne对蛋白质条带强度进行定量。

1.7统计学分析

采用软件SPSS22.0进行统计分析。计量资料用（±s）表示，采用t检验。计数资料用率表示，使用c2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1miR-630在喉癌组织和细胞系中的表达情况

相对于癌旁组织，喉癌组织中miR-630的表达明显上调，差异有统计学意义（t=8.882,P<0.0001）。相对于hacat细胞，TU212细胞中miR-630表达明显上调，差异有统计学意义（t=8.303,P<0.0001），见图1。

2.2miR-630在喉癌组织肿瘤病理分期和淋巴转移的差异

24例患者病理分期HE染色，见图2（封二）。将患者分为早期组（Ⅰ、Ⅱ期）和晚期组（Ⅲ、Ⅳ期），早期组10人，晚期组14人。晚期组癌组织中miR-630表达比早期组癌组织明显升高，差异有统计学意义（t=2.336,P=0.029），见图3。

2.3miR-630与TP53INP2的相关性

通过PubMed查阅miR-630的序列，在数据库平台miRWalk中预测miR-630的靶基因为TP53INP2。相对于正常组织和hacat细胞，TP53INP2在喉癌组织和TU212细胞中的表达均下调（P<0.05）。在喉癌组织中TP53INP2的表达与miR-630呈负相关（P<0.05），见图4。

图1miR-630在喉癌组织和细胞系中的表达

图3miR-630在喉癌组织中肿瘤病理分期差异

2.4转染后miR-630和TP53INP2的表达

在TU212细胞中转染siRNA后，相对于对照组和NC组，miR-630的表达明显降低，TP53INP2的表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图5A、B。蛋白印迹实验结果与PCR相似，见图5C。

图4TP53INP2的表达及其与miR-630的相关性

图5转染后miR-630和TP53INP2的表达

3、讨论

喉癌是一种常见的耳鼻喉科恶性肿瘤，早期症状主要为声音嘶哑、发音困难、呼吸困难和吞咽功能障碍。早期诊断和治疗对于喉癌的预后有重要的意义。近年来研究发现miRNA在喉癌中起着重要作用，尤其是对早期有诊断作用[3,4]，但是miRNA在喉癌中的研究还是相对较少。

最近报道的大量miRNA在癌症发生和发展过程中表现为致癌基因或肿瘤抑制因子，甚至有一些影响化学抗性[9]。很多研究已经发现miR-630在多种癌症中异常表达，但其表达似乎不一致。有研究报道miR-630在人胃癌中过度表达，并且与不良预后有关，可作为胃癌患者独立的预后因素[10]。miR-630在食管鳞状细胞组织样本中下调，其中异位miR-630表达抑制增殖、侵袭和转移[11]。相比之下，miR-630的表达已显示在结直肠癌中上调，其中它与较差的存活率相关[12]。同样，具有高miR-630表达的膀胱尿路上皮癌患者的预后比miR-630表达较低的患者更差[13]。另一项研究表明miR-630通过减少早期DNA损伤反应来抑制p53激活[14]。这说明miR-630可能在癌症发生发展中起着重要的作用，可能具有诊断和预后价值。然而，miR-630在喉癌中并无专门的研究。

本研究证明在喉癌组织中和细胞系中miR-630高表达，miR-630通过调节TP53INP2在喉癌细胞迁移中发挥作用。具体而言，miR-630靶向TP53INP2的3'-UTR并调节其水平，揭示了在LSCC进展中的新分子机制。本研究中，为进一步探讨miR-630在喉癌中的调控途径，通过在TU212细胞中进行SiRNA干扰验证了TP53INP2与miR-630的调控关系。

TP53INP2(tumorproteinp53induciblenuclearprotein2）也叫DOR，是一种双功能蛋白，可调节转录并增强饥饿诱导的自噬[15,16]。作为自噬的启动子，TP53INP2是LC3的核质转位所必需的，主要在细胞质中起作用。最近的研究表明，TP53INP2是一种在正常生长条件下经历核-细胞质穿梭的动态蛋白[16]。TP53INP2是如何进一步通过何种途径调控喉癌的发生发展，需要进一步研究。

综上所述，miR-630在LSCC中高表达，并且它的表达量可以有效预测LSCC的发生。miR-630的高表达与不良预后显著相关，它的表达量可有效预测LSCC患者的生存情况，这为LSCC的治疗提供了新的靶点和策略。

图2喉癌组织肿瘤病理分期（HE，×40)

参考文献：

[2]闵小玲,刘晓海.HPV亚型对喉磷状细胞癌及癌前病变的定性诊断价值[J].热带医学杂志,2017,17(9):1160-1163.

[3]吕鹏飞,肖莎,周静,等.肺癌遗传易感差异表达miRNA的筛选及生物信息学分析[J].中国热带医学,2019,19(8):719-722.

[4]黎文华,王鹏,陆伦根.microRNA-454在肿瘤中的研究进展[J].中国临床研究,2019,32(2):264-266.

[7]陈广理,龚树生,陈沛,等.Axl基因在喉癌细胞Hep-2中的表达及意义[J].河南科技大学学报:医学版,2014,32(3):170-172.

[8]邹平,胡国文,刘跃辉.海带多糖对喉癌细胞增殖和凋亡影响的实验探索[J].中国耳鼻咽喉头颈外科,2019,26(1):13-16.

刘涛,王玮,周洁,左晶晶,李芬.miR-630在喉鳞状细胞癌发展中的调控机制研究[J].热带医学杂志,2020,20(08):1013-1016+992.