肺腺癌是非小细胞肺癌中确诊病例最多的一种，被认为是一种侵袭性肿瘤[1,2,3,4]。相关流行病学数据表明，患者即使在接受各种治疗后，肺腺癌的5年生存率也<20%[5,6,7]。因此，识别新的分子靶点以及参与发病机制的信号通路至关重要[8,9]。microRNA(miRNA)可以通过靶向mRNA调节基因表达并参与许多重要的生物学过程[10,11,12]。研究表明，miRNA-423-5p与很多癌症的疾病预后相关[13,14,15,16,17]。miRNA-423-5p被认为是一种潜在的癌症生物标志物[18],并且miRNA-423-5p的过度表达被认为与肺腺癌的发生发展有关[19]。干扰素调节因子1(interferon regulatory factor 1, IRF1)在各种恶性肿瘤中经常下调[20],如白血病和结直肠癌[21,22]。然而，IRF1在肺腺癌中的表达及其上游调控机制尚未明确[23]。本研究拟探讨miRNA-423-5p是否可通过调控IRF1参与肺腺癌的发病过程，为肺腺癌的病变机制及靶向治疗研究提供参考。

1、材料与方法

1.1 细胞与实验动物

肺腺癌细胞A549、NCI-H1299(H1299)和NCI-H1975(H1975)购自武汉普诺赛生命科技有限公司，人正常肺上皮细胞Beas-2B购自北京中生奥邦生物科技有限公司。BALB/c-nu裸鼠24只，均为雄性，3周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司[动物许可证号：SCXK(京)2019-0008]。

1.2 主要试剂

RPMI 1640培养基(美国Gibco公司),CCK-8试剂盒(中国EallBio公司),5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine, EDU)细胞增殖检测试剂盒和双荧光素酶检测试剂盒(中国碧云天生物技术有限公司),Lipofectamine○R 2000(美国Invitrogen公司),miRNA-423-5p和IRF1引物、siRNA和阴性对照(中国广州锐博生物科技有限公司)。

1.3 细胞实验

1.3.1 细胞培养

肺腺癌A549、H1299、H1975和人正常肺上皮细胞(Beas-2B)用RPMI 1640完全培养基在细胞培养箱中培养。

1.3.2 细胞转染和分组

采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)实验检测3种肺腺癌细胞的miRNA-423-5p和IRF1表达，筛选出miRNA-423-5p相对高和IRF1相对低的细胞进行后续实验。按照Lipofectamine○R 2000和锐博ASO试剂盒说明书对筛选待测的肺腺癌细胞进行转染，通过qRT-PCR及蛋白质印迹法检测转染效果，实验分组如下：(1)在过表达miRNA-423-5p实验中，mimics NC作为对照组，miRNA-423-5p作为过表达组；(2)在敲降miRNA-423-5p实验中，ASO-NC作为对照组，ASO-miRNA-423-5p作为敲降组；(3)过表达IRF1实验中，pcDNA3.1作为对照组，pcDNA3.1-IRF1作为过表达组；(4)同时过表达miRNA-423-5p和IRF1实验中，mimics NC+pcDNA3.1作为对照组，miRNA-423-5p+pcDNA3.1作为只过表达miRNA-423-5p组，miRNA-423-5p+pcDNA3.1-IRF1作为同时过表达miRNA-423-5p和IRF1组。

1.3.3 RNA提取及qRT-PCR实验

用Trizol方法提取各组细胞RNA,使用中实同创的逆转录及扩增试剂盒进行qPCR实验，每组设6孔。引物序列见表1。

表1 miRNA-423-5p和IRF1的引物序列

1.3.4 CCK-8实验

使用CCK-8试剂盒检测各组细胞的细胞活力，每组设6孔。

1.3.5 克隆形成实验

各组细胞转染48 h后，取5×103个细胞接种于6孔板，待细胞成团后进行结晶紫染色，每组设6孔。

1.3.6 EDU实验

各组细胞转染48 h后，加入EDU(终浓度为10 μmol/L),继续培养2 h, 使用EDU细胞增殖检测试剂盒对细胞进行后续实验，用荧光显微镜拍照，每组设6孔。

1.3.7 划痕实验

各组细胞转染48 h后，用10 μL的枪头在6孔板每孔中间划线，用生理盐水清洗培养板，随后加入无血清培养基培养，按实验计划分别在0、24和48 h拍照，每组设6孔。

1.3.8 Transwell实验

侵袭实验：浓度为10%的Matrigel基质胶50 μL/孔包被Transwell小室2 h, 各组按8×104个/孔的细胞量接种于Transwell上室(200 μL/孔),下室加入650 μL含20%胎牛血清的培养基，培养24 h后，使用0.1%的结晶紫溶液染色15 min, 拍照计数，每组设6孔。迁移实验：不加Matrigel基质胶，其他步骤同侵袭实验，每组设6孔。

1.3.9 双荧光素酶报告实验

Star Base数据库预测显示，IRF1与miRNA-423-5p存在结合位点，推测IRF1为miRNA-423-5p的潜在靶基因并进行验证，根据IRF1-UTR区可能与miRNA-423-5p相结合的区域构建报告基因质粒，分组如下：mimics miRNA-423-5p+IRF1-UTR-WT组，mimics NC+IRF1-UTR-WT组，ASO-miRNA-423-5p+IRF1-UTR-WT组，ASO-NC+IRF1-UTR-WT组，mimics miRNA-423-5p+IRF1-UTR-MUT组，mimics NC+IRF1-UTR-MUT组，ASO-miRNA-423-5p+IRF1-UTR-MUT组，ASO-NC+IRF1-UTR-MUT组。转染48 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行后续实验。

1.3.10 蛋白质印迹法

1.3.2中各组细胞取30 μg蛋白样品进行电泳，Bax、Caspase-3和p53的稀释浓度为1∶500,Caspase-9和GAPDH稀释浓度为1∶1 000。4 ℃孵育过夜，羊抗兔IgG抗体(美国Sigma公司)稀释浓度为1∶10 000。室温孵育1 h, 用BCA显影液进行显影，每组设6孔。

1.4 动物实验

1.4.1 裸鼠实验

将24只3周龄雄性BALB/c-nu裸鼠随机分为4组，6只/组。将2×106个稳定敲降miRNA-423-5p的H1299细胞悬液0.1 mL注射于裸鼠左侧背部皮下，作为敲降miRNA-423-5p组。同时将2×106个mimics NC H1299细胞悬液0.1 mL注射于裸鼠左侧背部皮下，作为sh-NC组。将2×106个pcDNA3.1-IRF1的H1299细胞悬液0.1 mL注射于裸鼠左侧背部皮下，作为pcDNA3.1-IRF1组。 同时将2×106个pcDNA3.1 H1299细胞悬液0.1 mL注射于裸鼠左侧背部皮下，作为pcDNA3.1组。14 d后待皮下可触及肿瘤，提示各组荷瘤小鼠制备成功。连续饲养16 d, 正常喂食喂水，黑夜/白天：12 h/12 h, 环境温度(26±2) ℃,相对湿度(40±10)%。

1.4.2 免疫组化实验

荷瘤小鼠制备成功并连续饲养30 d后处死各组裸鼠。取出各组裸鼠的瘤体，对各组裸鼠的瘤体进行石蜡包埋制备并切片。按照中山金桥(PV 6000)试剂盒说明书进行免疫组化实验，Ki-67、PCNA(美国Sigma公司)抗体的稀释浓度为1∶500。最后按中山金桥(ZLI-9017)DAB显色试剂盒说明书显色。

1.5 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0对数据进行统计学分析。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，多组两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05(双尾)。

2、结 果

2.1 细胞实验

2.1.1 miRNA-423-5p和IRF1表达

qRT-PCR实验结果显示，miRNA-423-5p在A549(3.34±0.04)、H1975(3.21±0.55)、H1299(7.01±1.42)和Beas-2B细胞(2.92±0.42)表达差异有统计学意义，F=35.967, P<0.001;IRF1在A549(0.46±0.04)、H1975(0.10±0.01)、H1299(0.34±0.03)和Beas-2B细胞(1.00±0.09)表达差异有统计学意义，F=325.009, P<0.001。在A549、H1975和H1299细胞中，H1299细胞的miRNA-423-5p表达最高，IRF1表达相对较低，因而选择H1299细胞作为进一步研究的对象。

2.1.2 H1299细胞转染miRNA-423-5p和IRF1及敲降miRNA-423-5p的验证

与mimics NC组比，miRNA-423-5p组的miRNA-423-5p表达显著增高(1.02±0.28 vs 1.85±0.24,t=5.513, P=0.003)。与ASO-NC组比，ASO-miRNA-423-5p组的miRNA-423-5p表达显著降低(1.00±0.10 vs 0.56±0.05,t=9.640, P<0.001)。与pcDNA3.1组比，pcDNA3.1-IRF1组的IRF1表达显著增高(1.00±0.02 vs 4.18±0.01),t=556.034, P<0.001(图1)。

图1 pcDNA3.1-IRF1在H1299细胞中过表达  

2.1.3 对H1299细胞增殖和克隆能力的影响

与mimics NC组比，miRNA-423-5p组的细胞增殖(1.00±0.01 vs 1.39±0.01,t=67.550,P<0.001)、克隆(1.00±0.07 vs 1.49±0.02,t=16.487,P<0.001)和EDU均显著增高(1.00±0.10 vs 1.47±0.06,t=9.872,P<0.001)。与ASO-NC组比，ASO-miRNA-423-5p组的细胞增殖(1.00±0.01 vs 0.74±0.01,t=45.033, P<0.001)、克隆(1.00±0.08 vs 0.75±0.06,t=6.124, P=0.002)和EDU均显著降低(1.00±0.10 vs 0.43±0.08,t=10.903, P<0.001)。见图2A和图2B。

与pcDNA3.1组比，pcDNA3.1-IRF1组的细胞增殖能力(1.00±0.01 vs 0.56±0.02,t=48.200,P<0.001)、克隆(1.00±0.08 vs 0.39±0.02,t=18.120,P<0.001)和EDU均显著降低(1.00±0.16 vs 0.50±0.06,t=7.167,P<0.001)。见图2C。

与mimics NC+pcDNA3.1组比，miRNA-423-5p+pcDNA3.1组的细胞增殖(1.00±0.02 vs 1.44±0.02,t=38.105, P<0.001)、克隆 (1.00±0.29 vs 2.07±0.12,t=8.351, P<0.001)和EDU均显著增高(1.00±0.13 vs 2.70±0.17,t=19.458, P<0.001);与miRNA-423-5p+pcDNA3.1组比，miRNA-423-5p+pcDNA3.1-IRF1组的细胞增殖(1.44±0.02 vs 1.16±0.03,t=19.022, P<0.001)、克隆 (2.07±0.12 vs 1.18±0.33,t=6.208, P=0.002)和EDU均显著降低(2.70±0.17 vs 1.00±0.13,t=19.457, P<0.001)。见图2D。

2.1.4 对H1299细胞凋亡因子表达的影响

蛋白质印迹法发现，与mimics NC组比，miRNA-423-5p组的Caspase-3、Caspase-9、p53和Bax均显著降低；与ASO-NC组比，ASO-miRNA-423-5p组Caspase-3、Caspase-9、p53和Bax均显著增高。与pcDNA3.1组比，pcDNA3.1-IRF1组的Caspase-3、Caspase-9、p53和Bax均显著增高。见图3和表2。

与mimics NC+pcDNA3.1组比，miRNA-423-5p+pcDNA3.1组的Caspase-3、Caspase-9、p53和Bax均显著降低；与miRNA-423-5p+pcDNA3.1组比，miRNA-423-5p+pcDNA3.1-IRF1组的Caspase-3、Caspase-9、p53和Bax均显著增高。见图3和表3。

2.1.5 对H1299细胞迁移和侵袭能力的影响

划痕实验发现，与mimics NC组比，miRNA-423-5p组划痕后24和48 h距离均显著减少；与ASO-NC组比，ASO-miRNA-423-5p组划痕后24和48 h距离均显著增加。Transwell实验发现，与mimics NC组比，miRNA-423-5p组的侵袭能力显著增高；与ASO-NC组比，ASO-miRNA-423-5p组的侵袭能力显著降低。划痕实验发现，与pcDNA3.1组比，pcDNA3.1-IRF1组的划痕后24和48 h距离均显著增加。Transwell实验发现，与pcDNA3.1组比，pcDNA3.1-IRF1组的侵袭能力显著降低。见图4、图5和表4。

图2 miRNA-423-5p和IRF1对H1299细胞增殖的影响(×400)  

图3 miRNA-423-5p和IRF1对H1299细胞凋亡的影响  

划痕实验发现，与mimics NC+pcDNA3.1组比，miRNA-423-5p+pcDNA3.1组划痕后24和48 h距离均显著减少；与miRNA-423-5p+pcDNA3.1组比，miRNA-423-5p+pcDNA3.1-IRF1组划痕后24和48 h距离均显著增加。Transwell实验发现，与mimics NC+pcDNA3.1组比，miRNA-423-5p+pcDNA3.1组的侵袭能力显著增高；与miRNA-423-5p+pcDNA3.1组比，miRNA-423-5p+pcDNA3.1-IRF1组侵袭能力显著降低。见图4、图5和表5。

表2 miRNA-423-5p和IRF1对肺腺癌细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

表3 同时过表达miRNA-423-5p和IRF1对肺腺癌细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

图4 miRNA-423-5p和IRF1对H1299细胞迁移能力的影响(×100)   

图5 miRNA-423-5p和IRF1对H1299细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色，×100)   

表4 miRNA-423-5p和IRF1对肺腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

表5 同时过表达miRNA-423-5p和IRF1对肺腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

2.1.6 IRF1是miRNA-423-5p的靶基因 Star Base数据库显示，miRNA-423-5p含有IRF1的结合位点(图6)。

双荧光素酶报告实验显示，与mimics NC+IRF1-UTR-WT共转染组比，mimics miRNA-423-5p+IRF1-UTR-WT共转染组细胞的荧光素酶活性显著增高(0.95±0.05 vs 1.30±0.03,t=26.470, P<0.001);与ASO-NC+IRF1-UTR-WT共转染组比，ASO-miRNA-423-5p+IRF1-UTR-WT共转染组细胞的荧光素酶活性显著降低(1.00±0.02 vs 0.71±0.02,t=25.115, P<0.001);mimics NC+IRF1-UTR-MUT共转染组和mimics miRNA-423-5p+IRF1-UTR-MUT共转染组细胞的荧光素酶活性差异无统计学意义(0.98±0.03 vs 1.00±0.04,t=0.980, P=0.372);ASO-NC+IRF1-UTR-MUT共转染组和ASO-miRNA-423-5p+IRF1-UTR-MUT共转染组细胞的荧光素酶活性差异无统计学意义(1.00±0.03 vs 1.03±0.02,t=2.038, P=0.097)。

2.1.7 miRNA-423-5p表达对H1299细胞IRF1表达的影响

qRT-PCR实验发现，与mimics NC组比，miRNA-423-5p组的IRF1表达(1.65±0.19 vs 1.00±0.12,t=7.085, P=0.001)显著降低；与ASO-NC组比，ASO-miRNA-423-5p组的IRF1表达(0.56±0.02 vs 1.00±0.11,t=9.640, P<0.001)显著增高。

蛋白质印迹法实验发现，与mimics NC组比，miRNA-423-5p组的IRF1表达(1.00±0.03 vs 0.63±0.01,t=28.660, P<0.001)显著降低；与ASO-NC组比，ASO-miRNA-423-5p组的IRF1表达(1.00±0.03 vs 1.31±0.05,t=13.023, P<0.001)显著增高。见图7。

图6 miRNA-423-5p对IRF1的靶向调节作用   

图7 过表达miRNA-423-5p可抑制H1299细胞IRF1的表达   

2.2 动物实验

qRT-PCR实验发现，与sh-NC组比，敲降miRNA-423-5p组裸鼠瘤组织miRNA-423-5p表达降低(1.00±0.09 vs 0.10±0.01,t=24.345, P<0.001),瘤体体积缩小[(491.40±94.34) mm3vs (382.20±16.04) mm3, t=2.825,P=0.037],瘤组织Ki-67(0.40±0.10 vs 0.24±0.02,t=3.843, P=0.012)和PCNA表达(0.45±0.09 vs 0.25±0.04,t=4.974,P=0.004)均显著降低。见图8A。

蛋白质印迹法实验发现，与pcDNA3.1组比，pcDNA3.1-IRF1组裸鼠瘤组织IRF1表达(1.00±0.03 vs 3.36±0.23,t=24.923, P<0.001)显著增高，瘤体体积缩小[(291.50±109.1) mm3vs (125.46±98.52) mm3, t=2.766, P=0.040],瘤组织Ki-67(0.44±0.04 vs 0.25±0.02,t=10.407, P<0.001)和PCNA表达(0.39±0.03 vs 0.15±0.02,t=16.305, P<0.001)均显著降低。见图8B。

3、讨 论

由于缺乏可靠的生物标志物和治疗靶点，以及癌细胞化疗耐药性的增强，致使肺腺癌治疗的成功率不高[24,25,26,27]。在癌细胞中筛选新的生物活性分子或寻找治疗肺腺癌的新靶点至关重要。miRNA通常在癌细胞中失调，它们被认为是重要的治疗靶点[28,29,30,31]。有研究表明，miRNA-423-5p在胃癌细胞中低表达，过表达miRNA-423-5p可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力，并且circRNA-0000081可通过海绵化miRNA-423-5p来影响PDPK1的表达，从而促进胃癌的功能[32]。此外miR-423-5p上调可抑制胃癌细胞中cicRNA PVT1和SMAD3的表达，circRNA PVT1可通过miR-423-5p/Smad3信号轴参与调控上皮-间充质转化通路从而促进胃癌细胞的迁移和侵袭能力[33]。本研究发现，miRNA-423-5p在肺腺癌中高表达，并可促进肺腺癌细胞的增殖凋亡和侵袭迁移能力，说明miRNA-423-5p在多种癌症中具有类似的功能。

图8 免疫组织化学实验检测瘤组织Ki-67和PCNA的表达水平(DAB染色，×200)  

为了确定miRNA-423-5p在肺腺癌中的内部分子机制，本研究进行了生物信息学分析和文献调查，以确定相关的mRNA,通过双荧光素酶实验证明miRNA-423-5p直接与IRF1结合，随后的细胞功能实验发现IRF1的表达增加与肺腺癌细胞的生长抑制有关。有研究表明，PSAT1的上调可阻断IRF1及其下游IFIH1,通过抑制IFN-γ通路促进肺癌细胞侵袭[23]。该研究与本研究中IRF1在肺腺癌中可发挥的生物学作用相同。此外IFN-γ介导的IRF1激活可通过抑制IGF表达而抑制结直肠癌转移[34]。所以本研究猜测miRNA-423-5p的上调是否也可能通过阻断IRF1及其下游IFIH1或者IGF促进肺腺癌的恶性表型。因此IRF1调控肺腺癌细胞增殖迁移及侵袭的相关作用通路的分子机制可在今后的研究中进一步开展。通过细胞功能体外实验，本研究观察到过表达IRF1可以挽救过表达miRNA-423-5p对H1299细胞增殖凋亡和迁移侵袭能力的作用。这些结果在小鼠体内异种移植试验中得到证实，通过免疫组化分析发现，稳定敲降miRNA-423-5p和稳定过表达IRF1的H1299细胞形成的肿瘤组织体积比对照组小，Ki-67和PCNA蛋白的表达水平相对减少。本研究证实了IRF1受到miRNA-423-5p影响，这种miRNA上调降低了IRF1表达。除了miRNA-423-5p之外，有研究表明IRF1的表达也会受到miR-132-3p影响[35]。说明IRF1容易受到miRNA的调控作用，证明本研究结果较为可靠。

综上所述，本研究报道了肺腺癌中miRNA-423-5p和IRF1之间的序列特异性靶向作用，结果表明miRNA-423-5p可能通过调控IRF1参与肺腺癌的增殖凋亡及侵袭迁移能力，这为治疗肺腺癌提供了新的治疗靶点和策略。

基金资助:国家自然科学基金(82172658);唐山市小细胞肺癌医工融合精准诊疗基础创新团队(21130203D);华北理工大学公共卫生学院高水平科研创新团队建设计划(KYTD202309);

文章来源:崔逸爽,赵阅,吴亚男等.miRNA-423-5p和干扰素调节因子1对肺腺癌细胞影响的研究[J].中华肿瘤防治杂志,2024,31(01):1-10.