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miR-7靶向调控KLF4对结肠癌干细胞生物学行为的影响

2024-01-05 80 上传者：管理员

摘要：目的探讨微小核糖核酸7(miR-7)靶向调控Krüppe样因子4(KLF4)对结肠癌干细胞生物学行为的影响。方法体外传代培养结肠癌干细胞。取传15代、对数生长期、生长状态良好的结肠癌干细胞，随机分为对照组、NC mimics组、miR-7 mimics组，NC mimics组和miR-7 mimics组分别转染空载质粒、miR-7 mimics质粒，对照组不予转染。采用RT-qPCR法验证转染效率。收集各组转染48 h结肠癌干细胞，采用CCK-8法检测细胞活力，采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力，采用改良Boyden小室法检测细胞侵袭能力，采用流式细胞术检测细胞凋亡率。通过TargetScan在线网站预测miR-7与KLF4的结合位点，并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-7对KLF4的靶向调控作用。收集各组转染48 h结肠癌干细胞，分别采用RT-qPCR法、Western blotting法检测KLF4 mRNA和蛋白表达。结果 miR-7 mimics组miR-7相对表达量高于对照组和NC mimics组（P均<0.05），而对照组与NC mimics组比较差异无统计学意义（P>0.05）。miR-7 mimics组细胞存活率、细胞迁移率、穿膜细胞数均低于NC mimics组和对照组，细胞凋亡率高于NC mimics组和对照组（P均<0.05）;NC mimics组与对照组细胞存活率、细胞迁移率、穿膜细胞数、细胞凋亡率比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。经TargetScan在线网站预测，KLF4基因的3′非翻译区存在miR-7的结合位点；经双荧光素酶报告基因实验验证，miR-7对KLF4存在靶向调控作用。miR-7 mimics组KLF4mRNA与蛋白相对表达量均低于NC mimics组和对照组（P均<0.05），而NC mimics组与对照组比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。结论 miR-7可通过靶向下调KLF4表达而抑制结肠癌干细胞的增殖、侵袭、迁移并促进其凋亡。

关键词：
KLF4
Krüppe样因子4
微小核糖核酸7
结肠癌
遗传因素
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结肠癌是全球范围内发病率和死亡率均居前五位的恶性肿瘤，好发于40岁以上中老年人，并且男性多于女性[1,2]。目前，针对结肠癌的治疗方法有多种，但总体预后仍然较差[3]。因此，深入探索结肠癌发病的分子机制，从而实现精准治疗，对提高患者预后具有重要意义[4]。既往研究报道，遗传因素是导致结肠癌出现家族聚集的重要原因[5]。微小核糖核酸（mi RNA）是一类长度为21～25个核苷酸的非编码小分子RNA，可在表观遗传学水平上调控基因的表达。mi RNA异常表达与多种肿瘤的恶性生物学行为密切相关，并对肿瘤干细胞的功能维持和分化方向具有重要的调节作用[6]。作为mi RNA家族成员之一，mi R-7能够调控多种靶基因的表达，从而抑制肝癌、肺癌、胰腺癌等恶性肿瘤的发生、发展[7]。Krüppe样因子4(KLF4）是诱导多潜能干细胞形成所需的关键因子之一，在维持胚胎干细胞自我更新和多向分化潜能中发挥重要作用。有研究发现，mi R-7/KLF4信号轴能够参与牙周膜干细胞的成骨与分化[8]。但目前鲜见mi R-7/KLF4信号轴在结肠癌干细胞中作用的研究报道。2020年1月—2022年12月，本研究探讨了mi R-7靶向调控KLF4对结肠癌干细胞生物学行为的影响。现报告如下。

1、材料与方法

1.1 材料

结肠癌干细胞，由本院外科手术切除的结肠癌组织中分离获得，并于液氮罐中保存备用。引物序列、mi R-7 mimics质粒及其空载质粒（NC mimics）均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。倒置显微镜，购自日本OLYMPUS株式会社；微孔板阅读器，购自美国GE Health Care公司；i Bright凝胶成像系统、流式细胞仪，购自美国Thermo Fisher Scientific公司。原代细胞质粒DNA转染试剂盒，购自湖北艾普蒂生物工程有限公司；CCK-8，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，购自北京普利莱基因技术有限公司；RNA转录、提取及荧光定量试剂盒，购自美国Sigma公司；KLF4、β-actin一抗，购自美国Abcam公司；HRP标记的山羊抗兔Ig G二抗，购自上海优宁维生物科技股份有限公司。

1.2 细胞培养

取出液氮罐中保存的结肠癌干细胞，37℃水浴复苏。将复苏后的结肠癌干细胞接种于含10%FBS的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱常规培养。每3天更换一次培养基。当细胞生长至70%以上融合时，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3传代。

1.3 细胞转染

取传15代、对数生长期、生长状态良好的结肠癌干细胞，接种于6孔板，每孔1×106个，随机分为对照组、NC mimics组、mi R-7 mimics组，每组设6个复孔。将6孔板置于37℃、5%CO2的细胞培养箱常规培养。培养24 h，按原代细胞质粒DNA转染试剂盒说明，NC mimics组和mi R-7 mimics组分别转染空载质粒、mi R-7 mimics质粒；对照组常规培养，不予转染。转染48 h，收集细胞，按RNA提取试剂盒说明提取细胞总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。按RNA逆转录试剂盒说明，将总RNA逆转录合成为c DNA。以c DNA为模板，按实时荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列：mi R-7上游引物5′-CGTAGT-GCTGTAGCTAGTCGTA-3′、下游引物5′-TTGTGC-TAGTGCTAGTCCGT-3′，GAPDH上游引物5′-AAC-GTGAGATAGCTGCTGTGAT-3′、下游引物5′-CT-GATGTGTTAATATTCGTGTCA-3′。PCR反应体系共30μL:SYBR Green q PCR Super Mix 15.00μL,c DNA模板3.50μL，上下游引物各1.50μL,DEPC水8.50μL；反应条件：96℃3 min,96℃10 s、65℃4 s、72℃40 s共40个循环。PCR扩增反应完成后，绘制熔解曲线，获取循环阈值（CT）数。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。

1.4 细胞活力检测

采用CCK-8法。收集各组转染48 h结肠癌干细胞，接种于96孔板，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。常规培养24 h，每孔加入CCK-8溶液10μL，室温孵育3 h。然后通过微孔板阅读器检测450 nm波长处各孔的光密度（OD）值，按公式计算细胞存活率。细胞存活率=（实验孔OD450值-空白对照孔OD450值）/（对照孔OD450值-空白对照组OD450值）×100%。

1.5 细胞迁移能力检测

采用细胞划痕实验。收集各组转染48 h结肠癌干细胞，按5×105/m L密度接种于6孔板。将6孔板置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱常规培养48 h。用微量加样器枪头垂直在各培养孔中央作一划痕。继续培养48 h，倒置显微镜下拍照观察，按公式计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h划痕距离-48 h划痕距离）/0 h划痕距离×100%。

1.6 细胞侵袭能力检测

采用改良Boyden小室法。收集各组转染48 h结肠癌干细胞，取1×105个接种于用Matrigel基质胶包被的Boyden小室上室，Boyden小室下室加入含10%FBS的RPMI 1640培养基。然后将Boyden小室放入6孔板中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱培养。常规培养24 h，取出滤膜，用棉签擦去上室面残留细胞，甲醇固定，结晶紫染色，倒置显微镜下拍照，随机选取5个不重叠视野，计数每视野穿膜细胞数。

1.7 细胞凋亡检测

采用流式细胞术。收集各组转染48 h结肠癌干细胞，接种于6孔板，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱培养。常规培养24 h，用1×Binding Buffer重悬，制成密度为1×106/m L细胞悬液。取细胞悬液100μL，加入Annexin V-FITC5μL混匀，室温避光孵育15 min；再加入PI 10μL混匀，4℃避光孵育5 min；最后加入1×Binding Buffer400μL混匀，1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 mi R-7与KLF4的靶向结合位点预测与验证

通过Target Scan在线网站（http：//www.targetscan.org）预测mi R-7与KLF4的结合位点。取传15代、对数生长期、生长状态良好的结肠癌干细胞，接种于96孔板，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。常规培养24 h，按原代细胞质粒DNA转染试剂盒说明，将KLF4-WT（野生型）、KLF4-MUT（突变型）分别与NC mimics或mi R-7 mimics共转染结肠癌干细胞。转染48 h，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.9 KLF4表达检测

(1)KLF4 m RNA表达检测：收集各组转染48 h结肠癌干细胞，采用RT-q PCR法检测KLF4 m RNA相对表达量，具体步骤参照1.3。引物序列：KLF4上游引物5′-GTTCGTAGCTGATC-GTCGTAGCTA-3′、下游引物5′-TATGTAGTGTCGT-GCTGTAGC-3′，GAPDH上游引物5′-AACGTGAGA-TAGCTGCTGTGAT-3′、下游引物5′-CTGATGTGT-TAATATTCGTGTCA-3′。(2)KLF4蛋白表达检测：收集各组转染48 h结肠癌干细胞，提取细胞总蛋白，经BCA法蛋白定量合格。加入上样缓冲液，100℃水浴充分变性。取变性蛋白，SDS-PAGE分离。电泳结束，转印至PVDF膜上。然后用脱脂奶粉室温封闭，分别加入KLF4、β-actin一抗，4℃孵育过夜。次日，加入HRP标记的山羊抗兔Ig G二抗，室温孵育2 h,i Bright凝胶成像系统曝光并分析结果。

1.1 0 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 转染效率验证结果

对照组、NC mimics组、mi R-7 mimics组mi R-7相对表达量分别为1.00±0.00、1.02±0.07、1.89±0.17。mi R-7 mimics组mi R-7相对表达量高于对照组和NC mimics组（P均<0.05），而对照组与NC mimics组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 三组细胞活性、细胞迁移和侵袭能力以及细胞凋亡率比较

见表1。

表1 三组细胞活性、细胞迁移和侵袭能力以及细胞凋亡率比较（±s

2.3 mi R-7与KLF4的靶向结合位点预测与验证结果

经Target Scan在线网站预测，KLF4基因的3′非翻译区存在mi R-7的结合位点，见图1。双荧光素酶报告基因实验结果显示，共转染NC mimics与KLF4-WT及共转染mi R-7 mimics与KLF4-WT的结肠癌干细胞荧光素酶活性分别为1.04±0.05、1.53±0.12，二者比较差异有统计学意义（P<0.05）；共转染NC mimics与KLF4-MUT及共转染mi R-7 mimics与KLF4-MUT的结肠癌干细胞荧光素酶活性分别为1.01±0.07、1.04±0.06，二者比较差异无统计学意义（P>0.05）。

图1 mi R-7与KLF4的靶向结合位点示意图

2.4 三组KLF4 m RNA和蛋白表达比较

见表2。

表2 三组KLF4 m RNA和蛋白相对表达量比较（±s)

3、讨论

据报道，在全球范围内结肠癌是发病率和死亡率均居前五位的恶性肿瘤，每年新发病例超过190万例、死亡病例超过90万例[9]。我国是结肠癌负担较重的国家，结肠癌的发病率为15/10万～25/10万、死亡率为7/10万～13/10万[10]。目前对于结肠癌的发病机制尚未完全阐明。因此，深入探索结肠癌发病的分子机制，对寻找早期诊断的生物标志物和治疗靶点具有重要意义。

遗传因素在结肠癌的发生、发展中起重要作用。mi RNA是一类非编码单链小RNA分子，目前已证实其与肿瘤的发生、发展密切相关。mi R-7是mi RNA家族成员之一，定位于人9号染色体异构核蛋白K基因的第一个内含子中。mi R-7可在大脑、眼睛和胰腺等部位高表达，提示mi R-7在这些器官的发育中具有重要作用[11]。有研究发现，在胶质母细胞瘤中mi R-7低表达，而mi R-7过表达则可通过靶向EGFR、AKT而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移[12]。但目前鲜见mi R-7在结肠癌干细胞中作用的报道。本研究结果发现，mi R-7 mimics组mi R-7相对表达量高于对照组和NC mimics组，而对照组与NC mimics组比较差异无统计学意义，提示该方法成功将mi R-7转染至结肠癌干细胞中。进一步研究发现，mi R-7mimics组细胞存活率、细胞迁移率、穿膜细胞数均低于NC mimics组和对照组，细胞凋亡率高于NC mimics组和对照组；NC mimics组与对照组细胞存活率、细胞迁移率、穿膜细胞数、细胞凋亡率比较差异均无统计学意义。结果表明，mi R-7能够参与结肠癌干细胞的恶性生物学行为，上调mi R-7表达则可抑制结肠癌干细胞的增殖、侵袭、迁移并促进其凋亡。

KLF4是诱导多潜能干细胞形成所需的关键因子之一，在维持胚胎干细胞自我更新和多向分化潜能中发挥重要作用。有研究发现，mi R-7/KLF4信号轴能够参与牙周膜干细胞的成骨与分化[8]。但目前鲜见mi R-7/KLF4信号轴在结肠癌干细胞中作用的报道。本研究在筛选mi R-7作为靶基因后，发现mi R-7的下游靶点较多，如KLF4、EGFR、IRS-1、PAK-1、RAF-1和SATB1等，它们均参与肿瘤发生、发展中的关键信号传导[13]。因此，本研究将mi R-7的调控机制锁定在其上下游靶基因中。有研究报道，沉默KLF4可降低肿瘤干细胞比例，而其过表达则可导致肿瘤干细胞比例增加，表明KLF4在肿瘤的发生、发展中具有强大的致癌作用，但其具体作用机制尚不清楚[14]。有研究在结肠癌中发现KLF4过表达，并将其确定为早期侵袭性表型的标志[15]。作为一种转录因子，KLF4可通过抑制p53转录来阻止细胞衰老和凋亡，这可能是KLF4过表达后肿瘤细胞凋亡率降低的原因之一[16]。本研究结果发现，KLF4基因的3′非翻译区存在mi R-7的结合位点；经双荧光素酶报告基因实验验证，mi R-7能够靶向调控KLF4。进一步研究发现，mi R-7 mimics组KLF4m RNA与蛋白相对表达量均低于NC mimics组和对照组，而NC mimics组与对照组比较差异均无统计学意义。提示mi R-7可能通过靶向下调KLF4表达而抑制结肠癌干细胞的恶性生物学行为。

综上所述，mi R-7可能通过靶向下调KLF4表达而抑制结肠癌干细胞的增殖、侵袭、迁移并促进其凋亡。

参考文献:

[6]刘昌化,罗康宁,闫圣玉,等. miR-515-5p通过靶向TRIM31调控PI3K/AKT信号通路对结直肠癌细胞增殖､侵袭及迁移的影响[J].医学研究生学报,2022,35(5):478-484.

[10]吴春晓,顾凯,龚杨明,等. 2015年中国结直肠癌发病和死亡情况分析[J].中国癌症杂志,2020,30(4):241-245.

基金资助:上海市浦东新区科技发展基金事业单位民生科研专项(医疗卫生)项目(PKJ2021-Y24);

文章来源:常云丽,胥明,陈国裕等.miR-7靶向调控KLF4对结肠癌干细胞生物学行为的影响[J].山东医药,2024,64(01):11-15.