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丹参酮ⅡA抑制人结肠癌SW480细胞侵袭与转移

2024-12-13 102 上传者：管理员

摘要：目的探讨中药丹参酮(Tan)ⅡA对人结肠癌细胞系SW480细胞活力及侵袭转移力的影响。方法稀释TanⅡA(0.000、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000μmol/ml),将细胞系SW480用TanⅡA处理24 h, CCK-8法检测TanⅡA对SW480细胞活力的影响；Transwell穿膜试验检测TanⅡ对SW480细胞侵袭转移能力的影响；Western印迹实验检测结肠癌细胞转移相关蛋白表达变化。结果与0.000μmol/ml组比较，各浓度TanⅡA组间细胞活力抑制率差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell小室结果显示，20μmol/ml TanⅡA体外细胞侵袭实验可明显抑制SW620细胞的侵袭转移能力。Western印迹结果显示，与对照组比较，20μmol/ml TanⅡA处理24 h后E-上皮细胞钙黏蛋白水平显著上升，波形蛋白及基质金属蛋白酶-9表达水平显著下降(P<0.05)。结论 TanⅡA有良好的体外抗结肠癌的生物活性及抑制结肠癌细胞的侵袭能力。

关键词：
丹参酮ⅡA;SW480细胞
复发
细胞侵袭
细胞增殖
肿瘤转移
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结直肠癌(CRC)是我国及全球最为常见的消化道恶性肿瘤之一，已占到恶性肿瘤的第4位[1,2]。肿瘤细胞的侵袭转移作为恶性肿瘤最重要的标志之一，广泛的肿瘤转移也是造成CRC患者死亡及复发的主要原因[3,4]。临床上CRC患者多以中晚期为主，而此阶段癌症转移已明显发生，此时治疗多结合手术、放疗、化疗等综合手段，但患者疗效及预后仍不理想[5,6]。因此，探索CRC转移相关机制，研究发现治疗新靶点就显得尤为重要[7,8]。天然产物及其衍生物在CRC治疗中的应用日益广泛[9,10]。丹参酮(Tan)ⅡA是从丹参中提取，Tan衍生物具有保护心肌细胞、抗氧化应激和抑制炎症反应，广泛用于冠状动脉心脏疾病、心绞痛及心血管疾病治疗[11,12]。研究证实，TanⅡA可逆转肿瘤细胞的恶性表型，具有降低肿瘤迁移和侵袭的能力，对乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、肝癌、白血病、卵巢癌等多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，显示了其良好的抗肿瘤前景[13,14]。本研究体外检测TanⅡA对人肠癌SW480细胞活力及侵袭转移力的影响。

1、材料与方法

1.1实验试剂与细胞株

TanⅡA购于美国Sigma公司；噻唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)、人结肠癌细胞株SW480(长春晶美生物工程有限公司)。E-上皮型细胞钙黏蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶(MMP)-9、GAPDH抗体、Transwell小室及电化学发光(ECL)试剂(美国Pierce公司)。DMEM培养基及胎牛血清(美国Gibco公司)。

1.2细胞复苏、传代

从-80℃的冰箱里取出SW480细胞，用37℃水流快速溶解细胞至80%。将细胞取出至50 ml离心管中，加入10 ml预热磷酸盐缓冲液(PBS),吹打混匀离心机中离心3 min,抽弃上清液，加入10 ml预热的10%新生小牛血清的杜氏改良的Eagle培养基(DMEM)重悬细胞。

1.3 TanⅡA对SW480细胞活性测定

SW480细胞按1×105ml、100μl/孔接种于96孔板中，加入含10%胎牛血清及青链霉素的DMEM培养液，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，贴壁24 h后，弃细胞培养液，加入含终浓度为(0.000、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000μmol/ml)TanⅡA的DMEM培养液，培养24 h后，每孔加入10μl CCK-8测定溶液检测不同浓度TanⅡA对细胞的活性测定。每个浓度设置6个平行孔。试验重复3次，计算细胞活力。

1.4 TanⅡA对肿瘤细胞的侵袭实验

胰酶消化SW480细胞，重悬为单细胞悬液，调整细胞含量，选择1×104/孔加入上室，并加入500μl不含胎牛血清的DMEN培养液，在下室中加入500μl含10%胎牛血清的DMEM完全培养液，两室中分别加入含20、40μmol/ml TanⅡA,每组设3个复孔和空白对照孔。37℃、5%CO2的恒温培养箱中孵育24 h后，取出小室以95%乙醇室温固定15 min,结晶紫染色30 min,将小室内膜用刀片切下放置于载玻片上，倒置于相差倒置显微镜下观察，随机选取10个视野，计数每高倍视野平均细胞数并照相。

1.5 Western印迹检测肿瘤细胞相关蛋白

SW480细胞铺于6孔板中，细胞贴壁后以20μmol/ml TanⅡA处理24 h,经预冷PBS漂洗2次，置于冰冷裂解液冰上振荡30 min,参考文献裂解提取各组细胞总蛋白[15]。使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量法检测总蛋白浓度，取等量的各组细胞总蛋白(50μg)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电泳产物转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入已稀释的E-cadherin(稀释浓度1∶200)、Vimetin(稀释浓度1∶300)、MMP-9(稀释浓度1∶300)及GAPDH(稀释浓度1∶500)一抗中孵育，4℃过夜。再次用PBST洗膜后，再次加入稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(稀释浓度1∶2 000),室温置于摇床上孵育1 h。最后加入电化学发光(ECL)显示液，反应3 min,入暗室曝光45 s,洗膜后显影定影扫描分析。记录结果，带灰度值均以对应的内参照GADPH为基准进行校正，计算相对灰度值。

1.6统计学处理

采用SPSS17.0软件进行t检验。

2、结果

2.1 TanⅡA对SW480细胞增殖的影响

与0.000μmol/ml组比较，各组间细胞活力抑制率差异有统计学意义(P<0.05)。表明TanⅡA可明显抑制结肠癌SW480细胞株的增殖且呈剂量依赖性。但是当TanⅡA达到40.000μmol/ml时与20.000μmol/ml无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1不同浓度TanⅡA对SW480细胞增殖的影响

2.2 TanⅡA对结肠癌细胞的侵袭的影响

与空白对照组[(153.7±5.4)个/视野×10]比较，20.000、40.000μmol/ml TanⅡA可明显抑制SW620细胞的侵袭能力[(53.2±5.2)个/视野×10、(53.5±5.1)个/视野×10,P<0.05]。见图1。

2.3 Western印迹测定侵袭相关蛋白表达

与空白对照组比较，20.000μmol/ml TanⅡA可使E-cadherin表达显著上升，而Vimentin及MMP-9表达显著下降(P<0.05),见表2、图2。

图1 TanⅡA对结肠癌SW620细胞的侵袭的影响(结晶紫染色，×400)

表2两组细胞侵袭相关蛋白表达比较

图2 TanⅡA对细胞侵袭相关蛋白表达的影响

3、讨论

TanⅡA对多种肿瘤细胞具有杀伤、诱导分化和凋亡等作用。TanⅡA作为抗肿瘤药物具有较好的临床应用前景，已有研究表明，TanⅡA对宫颈癌、HL-60细胞和K562细胞具有诱导凋亡的作用，但作用机制仍有待深入研究[16,17]。

本研究结果证明，TanⅡA可有效抑制结肠癌细胞的转移。研究表明，E-cadherin表达的缺失可促使肿瘤细胞之间黏附力下降，进而使肿瘤细胞变得松散并倾向于向周围组织浸润，增加肿瘤的恶性程度[18]。另外E-cadherin和MMP-9是肿瘤细胞向周围基质细胞侵袭扩散的必须蛋白，且Vimentin和MMP-9基因表达水平越高，肿瘤的恶性程度越高[19,20]。

本研究结果说明，TanⅡA可改变结肠癌细胞的肿瘤转移相关蛋白表达谱。相关蛋白表达谱结果表明TanⅡA能够通过抑制结肠癌SW480细胞增殖及侵袭，其机制可能为TanⅡA可显著改变结肠癌相关蛋白表达谱，为结肠癌的药物治疗提供了新的途径和理论依据，与宋康杰[20]报道白藜芦醇抑制醇结肠癌细胞的肿瘤转移一致。

参考文献:

3高剑敏,田宏艳,相秀英,等.丹参酮ⅡA对人胰腺癌细胞的增殖和迁移抑制作用研究[J].解剖科学进展,2023;29(6):615-7.

10张转红,刘婷,高飞云,等.中药抑制结肠癌血管生成的作用机制研究进展[J].中草药,2023;54(3):948-55.

15母润红,马方,刘永超,等.特异性干扰survivin基因表达对人舌癌Tca8113细胞体外增殖和侵袭性的影响[J].中国免疫学杂志,2017;33(9):1310-4.

17刘志刚,孔祥雨,陈曦,等.丹参酮ⅡA对人宫颈鳞癌细胞SIHa增殖及凋亡的影响[J].毒理学杂志,2018;32(1):58-61.

20宋康杰.白藜芦醇阻断转化生长因子-/Smad通路抑制人结肠癌细胞系SW480侵袭转移实验研究[J].浙江中西医结合杂志,2016;26(1):27-30.

基金资助:吉林省科学技术厅科技发展项目(20190201052JC);

文章来源:王铁岩,王大伟.丹参酮ⅡA抑制人结肠癌SW480细胞侵袭与转移[J].中国老年学杂志,2024,44(23):5792-5795.