胃癌（gastriccancer,GC）是世界范围内第五大最常见的恶性肿瘤类型，是导致患者死亡的第三大原因，胃癌的预防和治疗是一个重要的公共卫生问题[1,2]。近几十年来，虽然全球胃癌发病率呈稳步下降趋势，但胃癌仍是一种常见的恶性肿瘤，有效治疗手段有限，5年生存率仅为30%左右[3,4]。因此，研究胃癌发生发展的调控机制并寻找新的治疗靶点，对于提高临床治疗效果具有重要意义。锌指蛋白367(ZNF367）是锌指蛋白家族中的一员，在胚胎或胎儿红细胞组织中表达，而在正常成人组织中不表达。近年来的研究发现，ZNF367可以抑制肺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌等的发生和发展[5,6]。但是在胃癌研究中还没有被报道过。microRNAs(miRNAs）是一种内源性表达的单链非编码小RNA，一般为18～23nt，可调控数以百计的靶mRNA进行翻译抑制或降解[7]。miRNAs在调节许多肿瘤细胞过程中起着关键作用，它们可以调节多种信号通路，包括癌基因和抑癌基因的信号通路，如PI3K/Akt，从而影响肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡等生物学行为[8,9]。本研究旨在探究ZNF367对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响，分析miR-21-5p与ZNF367的相关性，进一步探讨miR-21-5p/ZNF367分子轴调控胃癌细胞增殖和迁移能力的分子机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1组织样本

采集2015年8月–2018年10月上海市第八人民医院普外科手术切除46例胃癌患者癌组织及配对的癌旁组织标本（距肿瘤组织>3cm），所有标本取出后立即放入液氮中，并于–80℃长期保存。手术前未进行过任何放疗或化疗等治疗。组织样本的收集和使用征得患者同意并签署知情同意书，并获得上海市第八人民医院伦理委员会的批准。

1.1.2细胞系及主要试剂

胃癌细胞（MKN-45、MGC-803）以及人胃黏膜上皮细胞（GES-1）细胞购自中科院昆明细胞库；RPMI1640、DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清均购自美国Gibco公司；Trizol和LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；RNA提取试剂盒和荧光定量PCR试剂盒SYBRpremixExTaqTM购自日本Takara公司；CCK8试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司；双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；抗ZNF367、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、p-PI3K、p-Akt和GAPDH抗体以及二抗均购自美国Abcam公司；ECL化学发光显色液购自北京索莱宝公司。

1.2方法

1.2.1载体构建与细胞转染

miR-21-5pmimic、miR-21-5pinhibitor、pcDNA空载体、pcDNA-ZNF367和siRNA-ZNF367质粒由上海聚公生物科技有限公司构建。

GES-1和MGC-803细胞株用含10%FBS、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI1640培养基于37℃、5%CO2恒温培养箱培养。细胞转染前一天将细胞按2×105个/孔接种于6孔板中，使用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒分别将pcDNA-ZNF367、siRNA-ZNF367、miR-21-5pmimic、miR-135ainhibitor、pcDNA空载体转染至MGC-803细胞，转染后将细胞置于37℃、5%CO2培养箱内培养48～72h。

1.2.2qRT-PCR检测基因表达水平

使用Trizol试剂盒提取GC组织及细胞株中的总RNA,NanoDrop2000分光光度计检测RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。在PCR仪上进行反转录反应，反应体系为37℃，20min;85℃，5s;4℃，5min。在LightCycler®96SystemRealtimePCR仪上进行PCR反应。使用SuperRealPreMix(Probe）试剂盒进行qRT-PCR实验。反应程序：2×SuperRealPreMix10μl、正向引物0.8μl、反向引物0.8μl、cDNA模板3μl、ddH2O补足到20μl。使用GAPDH作为内参基因来标准化结果，相对表达水平参照文献[10]来计算。引物由上海铂尚生物科技有限公司合成。引物序列见表1。

表1引物序列

1.2.3Westernblot检测蛋白表达水平

分别收集对数生长期的细胞5×106个，使用RAPI裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度及纯度。蛋白质定量后进行10%SDS-PAGE分离蛋白，电泳后将蛋白质转移至PVDF膜、5%脱脂乳粉中封闭2h，一抗4℃过夜孵育。次日，PBST漂洗3次，每次5min，加入二抗，室温孵育2h，再PBST漂洗3次，每次5min，用ECL显影液使底物显色，并于凝胶成像系统中进行显影，然后采用ImageJ软件进行灰度值分析。每次实验进行3次平行重复。

1.2.4细胞增殖能力检测

细胞增殖能力采用CCK8试剂盒检测。实验前1天将质粒（pcDNA-ZNF367、siRNA-ZNF367、miR-21-5pmimic、miR-21-5pinhibitor、pcDNA空载体）转染处于对数生长期的MGC-803细胞，随后接种于96孔板，每孔100μl，置于37℃培养箱中培养4～6h至细胞完全贴壁，每孔加入10μl10%CCK8溶液，37℃培养箱孵育2h，然后使用酶标仪检测450nm处的光密度（OD）值，每组3个重复孔。

1.2.5细胞迁移能力检测

将质粒（pcDNA-ZNF367、siRNA-ZNF367、miR-21-5pmimic、miR-21-5pinhibitor、pcDNA空载体）转染生长对数期的MGC-803细胞，随后接种于6孔板上，形成融合的单层细胞。然后用200μl移液枪枪头将单层细胞划成一条直线，用PBS冲洗一遍，加入全营养DMEM培养基，分别在0h和24h进行拍照。

1.2.6双荧光素酶报告基因检测

构建pLuc-ZNF367和pLuc-ZNF367-MUT质粒，分别与miR-NC和miR-21-5p共转染MGC-803细胞。培养48h后，收集细胞后使用PBS清洗，用PLB裂解细胞，取上清液10μl于96孔板，每孔加入10μlLuciferaseAssayReagentII，随后使用双荧光素酶报告基因检测系统进行萤火虫和海肾荧光素酶活性检测，每个样品重复3次。

1.3统计学处理

采用SPSS20.0软件进行数据的统计分析，采用GraphpadPrism8.0软件绘图。所有实验平行独立重复3次。计量资料如果数据满足正态分布及方差齐，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，非正态分布或非方差齐性资料采用U检验。以*P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1ZNF367在胃癌组织和细胞系中呈低表达

qPCR实验检测结果表明，胃癌组织中ZNF367的基因表达显著低于癌旁组织（P<0.01，图1A）；而miR-21-5p的表达显著高于癌旁组织（P<0.01，图1B）。ZNF367在胃癌细胞系（MGC-803和MKN-45）中的表达水平显著低于正常胃上皮黏膜细胞（GES-1)(P<0.01，图1C），而miR-21-5p的表达显著高于胃癌细胞系（P<0.01，图1D）。在MGC-803细胞中的表达水平趋势更明显，故选择该细胞株进行后续实验。通过数据库（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service）分析表明，ZNF367低表达组的总存活率显著低于高表达组（P=6e-05，图1E）。Westernblot实验结果表明，ZNF367在MGC-803和MKN-45细胞株中的蛋白表达水平显著低于GES-1细胞株（P<0.05，图1F）。实验结果表明：ZNF367是胃癌发生发展的抑制基因，并且ZNF367低表达时具有不良的预后。此外，其还可能是miR-21-5p的潜在靶基因。

图1ZNF367与miR-21-5p在GC组织和细胞中的表达及预后分析（A～B:ZNF-367和miR-21-5p在癌旁组织和胃癌组织中的表达分析，**P<0.01;C～D:ZNF367和miR-21-5p在对照细胞和胃癌细胞中的表达分析，**P<0.01;E：胃癌病人总生存率分析；F：胃癌细胞中ZNF367蛋白表达分析）

2.2ZNF367可以抑制胃癌细胞的增殖和迁移

CCK8实验结果显示：过量表达ZNF367的细胞的增殖能力显著低于对照组。而抑制ZNF367表达的细胞的增殖能力显著高于对照组（**P<0.01，图2A）。由图2B可以看出miR-21-5p对于胃癌细胞增殖的影响与ZNF367是相反的（**P<0.01、*P<0.05）。细胞划痕实验结果（图2C）显示：过量表达ZNF367的细胞的迁移能力显著低于对照组。而抑制ZNF367表达的细胞的迁移能力显著高于对照组。miR-21-5p对于胃癌细胞增殖和迁移的影响与ZNF367是相反的。由此可以看出：ZNF367可以抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力，进一步表明ZNF367可能是miR-21-5p的潜在靶基因。

图2ZNF367与miR-21-5p对MGC-803细胞增殖和迁移能力影响分析（A：转染siRNA-ZNF367和OE-ZNF367的MGC-803细胞增殖能力分析，**P<0.01;B：转染miR-21-5pmimic和miR-21-5pinhibitor的MGC-803细胞增殖能力分析，**P<0.01,*P<0.05;C：转染siRNA-ZNF367、OE-ZNF367、miR-21-5pmimic和miR-21-5pinhibitor的MGC-803细胞迁移能力分析，标尺：100μm)

2.3ZNF367的3'UTR是miR-21-5p的直接作用靶点

通过靶基因预测网站（http://www.targetscan.org/vert＿72/）寻找ZNF367靶基因，结果显示ZNF367的3′UTR区域确实包含miR-21-5p的结合位点（图3A）。miR-21-5pmimic、miR-21-5pinhibitor转染MGC-803细胞后，qRT-PCR结果显示在转染miR-21-5pmimic的细胞中，ZNF367的基因和蛋白表达量都显著低于对照组（**P<0.01，图3B,3C），而在转染miR-21-5pinhibitor的细胞中，ZNF367的基因和蛋白表达量都显著高于对照组（**P<0.01，图3B,3C）。双荧光素酶报告基因系统结果显示，miR-21可以显著抑制ZNF367-WT的活性，而不能抑制ZNF367-MUT的活性（**P<0.01，图3D）。表明ZNF367的3′UTR是miR-21-5p的直接作用靶点。此外，过量表达miR-21-5p还可以促进EMT过程，而干扰miR-21-5p抑制EMT过程（**P<0.01，图3E、3F）。以上结果表明miR-21-5p可能通过ZNF367来影响细胞的EMT过程。

图3ZNF367靶向结合miR-21-5p并影响EMT相关蛋白的表达（A:ZNF367的3'UTR区域包含miR-21-5p结合位点；B：转染control/miR-21-5pmimic/miR-21-5pinhibitor的MGC-803细胞中ZNF367的基因表达分析，**P<0.01;C：转染control/miR-21-5pmimic/miR-21-5pinhibitor的MGC-803细胞中ZNF367的蛋白表达分析，**P<0.01;D：相对荧光素酶活性分析，**P<0.01;E:EMT信号通路基因表达分析，**P<0.01;F:EMT信号通路蛋白表达分析）

2.4miR-21-5p/ZNF367分子轴通过PI3K/Akt通路抑制胃癌细胞的增殖和迁移

Westernblot和qRT-PCR结果显示：在miR-21-5pinhibitor转染细胞中，ZNF367的表达显著提高，而p-Akt、p-PI3K的表达显著降低；而在miR-21-5pmimic转染细胞中，ZNF367的表达显著降低，而p-Akt、p-PI3K的表达显著提高（**P<0.01，图4A、4B）。结果表明：miR-21-5p/ZNF367分子轴通过PI3K/Akt通路抑制胃癌细胞的增殖和迁移。

图4miR-21-5p/ZNF367分子轴通过PI3K/Akt通路影响胃癌细胞的增殖和迁移（A：转染control/miR-21-5pmimic/miR-21-5pinhibitor的MGC-803细胞中PI3K/Akt通路相关基因表达分析，**P<0.01;B：转染control/miR-21-5pmimic/miR-21-5pinhibitor的MGC-803细胞中PI3K/Akt通路相关蛋白表达分析）

3、讨论

锌指蛋白是自然界一大类转录因子，可以结合靶基因从而调控下游基因的转录[11]。Cys2/His2型锌指蛋白是其中较大的一类，其中一些已被发现与癌症的发生和发展密切相关[12,13]。研究发现ZNF382位于19号染色体的长臂上，在调节结肠癌和鼻咽癌细胞的增殖和凋亡等多种细胞过程中发挥着重要作用[14,15]。Westernblot和qRT-PCR实验表明ZNF268在人卵巢癌中呈现高表达，ZNF268基因敲除和细胞迁移实验表明，ZNF268基因可能通过促进细胞周期来增加SKOV-3细胞的生长[16]。ZNF367可以影响肺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌等的发生和发展[5,6]。但是关于ZNF367是否影响胃癌的发生和发展目前还不清楚，本研究克隆了胃癌细胞中的ZNF367，其在胃癌组织和细胞中呈现低表达，实验结果表明其是胃癌细胞发展的抑制因子。与锌指蛋白其他成员不同，ZNF367在胃癌的发展过程中起到抑制作用。

miRNAs是一类进化上十分保守、长度为20～23nt的核苷酸非编码单链小分子RNA，是目前的研究重点[17]。miR-21在癌症的发生发展过程中起着至关重要的作用[18]。研究表明miR-21可以通过结合PTEN的3'UTR区域来抑制胃癌和非小细胞肺癌的增殖和侵袭[19,20]。miRNA-21还被证明可以同时结合PTEN和PDCD4蛋白进而抑制胆管癌细胞的增殖[21]。然而，miR-21-5p能够结合锌指蛋白家族的报道还比较少。本研究的靶点预测分析、双荧光素酶实验和qRT-PCR实验表明ZNF367的3'UTR是miR-21-5p的直接作用靶点。由此可见，miR-21-5p可以参与多种途径来调控癌症的发生和发展。本研究进一步丰富了miR-21-5p在肿瘤进展方面的功能。

PI3K/Akt信号通路是具有酶活性的细胞内信号转导通路。研究发现人类的多种肿瘤如胃癌、大肠癌、乳腺癌、肝癌、肾癌等均与PI3K/Akt信号通路密切相关，且PI3K/Akt信号通路中多种上下游分子的表达量改变均可影响肿瘤的发生和发展[22,23]。研究发现，ZNF407可以通过PI3K/Akt信号通路来影响肠胃癌的发生和进展[22]。在口腔鳞状细胞癌中，过量表达ZNF703可以通过PI3K/Akt/GSK-3β信号促进细胞增殖和转移[24]。本研究通过qRT-PCR和Westernblot实验发现了miR-21-5p/ZNF367分子轴通过PI3K/Akt通路抑制胃癌细胞的增殖和迁移。

总之，本研究探究了胃癌发展过程中的新的机制，也为胃癌的诊断和治疗提供了新的实验依据。

赵志东,郇金亮,汤文俊,秦贤举.hsa-miR-21-5p/ZNF367分子轴通过PI3K/Akt通路影响胃癌细胞的增殖和迁移[J].中国医药生物技术,2020,15(03):269-276.