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监测肺腺癌转移中应用外周血循环肿瘤细胞阴性富集联合FISH技术的价值

2020-07-01 286 上传者：管理员

摘要：目的探究外周血循环肿瘤细胞(CTC)阴性富集联合免疫荧光原位杂交(FISH)技术在监测肺腺癌中的意义。方法选取2018年1月-2019年1月河南省南阳市第二人民医院肺腺癌患者150例，均应用外周血CTC阴性富集联合FISH技术检测，分析外周血CTC在临床不同分期阳性率。结果150例肺腺癌患者中CTC阳性率达55.33%；临床分期越晚，CTC阳性率越高(P<0.05);M1期CTC阳性率较M0期高(P<0.05)。结论CTC阳性率与肺腺癌临床不同分期密切相关，同时外周血CTC阴性富集联合FISH技术可为临床病情评估、预防转移复发、选择针对性治疗方案、判断预后提供数据支持。

关键词：
CTC
FISH技术
外周血
肺腺癌
肿瘤细胞
阴性富集
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肺腺癌作为肺癌常见类型，患病率约占肺癌总人数的40%，早期仅伴随痰血、胸痛等表现，大部分患者确诊时已发生癌细胞远处转移等现象，严重威胁患者生命安全[1]。因此早期有效判断、预测及实施针对性治疗方案尤为重要。相关研究发现，循环肿瘤细胞(CTC)作为“肿瘤液态活检”，可于肿瘤早期扩散至全身血液，是肺腺癌无进展生存期与总生存期的独立预后因素[2]。基于此，本研究选取150例肺腺癌患者，探究外周血CTC阴性富集联合免疫荧光原位杂交(FISH)技术在监测转移中的应用价值，现详情如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取河南省南阳市第二人民医院肺腺癌150例(2018年1月～2019年1月)，其中男73例，女77例，年龄42～77岁，平均年龄(58.63±7.14)岁；临床分期：16例Ⅰa期，21例Ⅰb期，10例Ⅱa期，10例Ⅱb期，17例Ⅲa期，11例Ⅲb期，12例Ⅲc期，21例Ⅳa期，32例Ⅳb期。本研究经本院医学伦理委员会审批同意。

纳入标准：(1)原发肿瘤为肺癌；(2)既往未接受抗肿瘤治疗者；(3)临床分期Ⅰ～Ⅳ期；(4)知情并签署同意书。

排除标准：(1)存在其他恶性肿瘤者；(2)合并心、脑、肾、肝等严重病变者；(3)既往有器官移植史者；(4)存在血液系统疾病者；(5)合并意识不清、认知障碍或精神疾病，无法配合研究者。

1.2方法

1.2.1外周血CTC阴性富集

样本收集：空腹取≥7.5mL外周血，应存放于专业BD抗凝管，并于2d内检测，离心处理(离心机从转速0升至最高速时间应为100s，从最高速至停止时间应为300s)，同时将10×hCTC缓冲液加入超纯水配制成1×hCTC缓冲液，且操作前预热时间≥20min。试剂盒购自赛特公司，严格按照试剂盒说明书操作。

操作步骤：(1)去除血浆：头尾颠倒混匀采血管，配平，常温1956rpm(或800g)，离心8min，弃上清至棕红色沉淀(上处0.5cm处)；(2)样本转移：去上清后，剩余样本倒入离心管A中(50mL),1×hCTC缓冲液(1mL)洗涤采血管2次，洗涤液转入A管；(3)去除红细胞：取hCTCSeparationMatrix(3mL)于离心管B，将管A中血细胞叠加至分离介质上；A管洗涤应用1×hCTC缓冲液(1mL)，经壁缓慢注入B管；(4)吸取白膜层：配平，离心450g(1467rpm)，离心8min；将白膜层及上清转移至离心管C;(5)清洗磁珠：按200μL/人份取磁珠于离心管(平底，2mL)，加入1×hCTC缓冲液1mL，轻柔吹打混匀，在磁力架上放置60s后弃上清，再1×hCTC缓冲液重悬至原体积；(6)吸附白细胞：离心管C中，分别加入清洗后磁珠(200μL)，混匀，将离心管倾斜(约30°)置于摇床上，离心130rpm，摇动10min;(7)去除白细胞：取hCTCSeparationMatrix(3mL)于D管，将管C中的磁珠混悬液叠加至分离介质上；配平，450g(1467rpm)离心8min;(8)去除白细胞：离心后，沉淀以上所有液体，并移至E管50mL，保留至磁珠上方100μL处；(9)于E管加入1×hCTC缓冲液，直至E管体积为45mL，配平，离心700g(1830rpm)离心5min；离心后去除上清至1mL，增加0.5mL1×hCTC缓冲液，对沉淀物行轻柔吹打处理，将液体移至离心管(平底，2mL);(10)去除残余白细胞：将上述离心管放于磁力架上，时间为180s；接着以移液枪(1mL)将上述离心管液体(2mL)移至F管(50mL)；洗涤CTC细胞：F管加入1×hCTC缓冲液，直至F管体积为45mL，保留加样枪头，并洗涤吹打，配平，离心650g(1763rpm)，离心5min；弃上清至1mL，轻晃F管，混匀细胞；去除残留红细胞：用hCTCTreatment缓冲液清除红细胞；二次洗涤CTC细胞：F管中再次增加1×hCTC缓冲液至体积35mL，配平，650g，离心5min；弃上清至100μL，并以移液枪混匀；固定和涂片：按100μL/人加入固定液，涂片，室温过夜晾干玻片。

1.2.2FISH技术

取200～300μL固定液，全部覆盖标本区域，并于室温条件下固定8min。吸除固定液，并于多个染色缸依次浸泡标本，以起到脱水作用。每个标本区加入CEP8探针(10μL)，盖上盖玻片。吸取封片胶，并将盖玻片边缘封住。将封好载玻片置于杂交仪(购自无锡杰瑞安仪器设备有限公司)，参数设置为：杂交37℃，1.5h；变性76℃，5min。取标本，撕封胶，去除盖玻，洗片。按一定比例[20μLCD45～AF594荧光抗体/人份、180μLBSA溶液(2%)]调制抗体工作液，染色，盖片遮光保存。

1.3CTC阳性判定标准

于荧光显微镜下，正常细胞：CD45呈阳性或二倍体信号；异常细胞：≥三倍体且CD45呈阴性；CTC阳性：荧光显微镜下，≥2个异常细胞。

1.4观察指标

(1)CTC阳性率。(2)CTC与肺腺癌临床病理特征关系

1.5统计学分析

采用SPSS25.0软件分析数据，计数资料用n(%)表示，行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1CTC阳性率

150例肺腺癌患者中，CTC阳性率为55.33%(83/150)。

2.2CTC与肺腺癌临床病理特征关系

临床分期越晚，CTC阳性率越高(P<0.05);M1期CTC阳性率较M0期高(P<0.05)，见表1。

表1CTC与肺腺癌临床病理特征关系

3、讨论

肿瘤复发与转移是肺腺癌患者死亡主要原因。由于肿瘤细胞可进入淋巴及血液循环，进而促进远处转移灶形成，但临床实践证明，常规检测方法无法准确监测转移过程[3]。CTC在血液中含量极低，故检测CTC前需采用富集措施，而免疫磁珠法、基于形态学富集法是现阶段临床常用手段，其中基于形态学富集法虽费用便宜、操作难度小，但其特异性较差，无法监测肿瘤细胞转移过程；而免疫磁珠法主要包含阳性与阴性2种，有助于提高阳性检出率，监测肿瘤细胞转移与复发过程[4]。

本研究数据表明，150例肺腺癌患者中CTC阳性率达55.33%。可见肺腺癌出现CTC全身扩散。因此，通过检测CTC可及早发现肺腺癌转移高危人群，有助于降低肺腺癌转移发生可能性。本研究还发现，临床分期越晚，CTC阳性率越高(P<0.05)。表明CTC阳性率与肺腺癌临床不同分期密切相关。另外，相关研究发现，外周血CTC阴性富集联合FISH技术可及时精准监测肿瘤细胞远处转移，为临床评估病情变化、选择个体化治疗方案、判断预后效果提供循证指导[5]。本研究结果显示，M1期CTC阳性率较M0期高(P<0.05)。提示外周血CTC阴性富集联合FISH技术有助于及时发现肺腺癌病情转移。

综上可知，CTC阳性率与肺腺癌临床不同分期密切相关，同时外周血CTC阴性富集联合FISH技术可为临床病情评估、预防转移复发、选择针对性治疗方案、判断预后提供数据支持。

参考文献：

[1]房延凤,张红军,金发光,等.MicroRNA-182在人肺腺癌中的表达及其临床意义[J].中国现代医学杂志,2017,27(26):72-75.

[2]江晓聪,潘秀花,蓝玉宏.CTC和肿瘤标志物在监测转移性乳腺癌疗效及预后中的价值[J].热带医学杂志,2018,18(8):1084-1087.

[3]杨平,魏建昌,张通,等.外周血循环肿瘤细胞检测在结直肠癌转移早期诊断中的应用[J].中国医师进修杂志,2017,40(8):735-737.

[4]张静,蒋婷婷,陈念永.循环肿瘤细胞检测及SEiFISH技术检测循环肿瘤细胞的临床应用[J].华西医学,2017,32(7):1100-1103.

[5]沈茜,沈丽莎,陈茜,等.染色体着丝粒探针荧光原位杂交法检测血液循环肿瘤细胞对非小细胞肺癌的诊断价值[J].中华结核和呼吸杂志,2018,41(10):772-777.

刘丽娜,尹先哲,李毅星,刘源,王延朋,邢艳丽,王苗.外周血循环肿瘤细胞(CTC)阴性富集联合FISH技术在监测肺腺癌转移中的应用价值[J].临床研究,2020,28(06):17-18.