肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤，发病率和死亡率均居恶性肿瘤之首，严重威胁人类健康。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最主要的类型，占肺癌总数约85%[1]。近年来大量实验研究表明环氧化酶-2(COX-2）在炎症组织和肿瘤组织中高表达，而在正常组织中低表达[2],COX-2在肿瘤细胞的生长、增殖过程中起重要作用，它可促进肿瘤细胞增殖，促进肿瘤的侵袭、转移，抑制肿瘤细胞凋亡等，这些作用特点使得COX-2成为研究肿瘤的新靶点。尼美舒利正是选择性COX-2抑制剂，研究发现其对体外多种肿瘤细胞有明显的抑制作用。有报道尼美舒利具有明确的抑制宫颈癌细胞的作用[3]；还可通过降低β-catenin蛋白表达有效促使结肠癌细胞凋亡[4]；可通过抑制HSP70表达来诱导人肝癌SMMC7721细胞凋亡[5]。研究还发现尼美舒利可促进肿瘤细胞对传统化疗药的敏感性，有报道尼美舒利与奥沙利铂联用，能增强奥沙利铂对食管癌的抑瘤作用，降低奥沙利铂对大鼠免疫功能的抑制程度[6]。尼美舒利是否对肺癌细胞也有抑制作用。吉西他滨临床常用于非小细胞肺癌的治疗，本研究主要探讨尼美舒利与吉西他滨联用是否具有协同的抗肿瘤增殖的作用，并初步探讨其作用机制。

1、材料

1.1试药

尼美舒利（天津药物研究院有限公司，质量分数为99.0%，批号1808082）；注射用盐酸吉西他滨（江苏豪森药业集团有限公司，规格0.2g/支，批号180204);RPMI-1640培养液（Gibco公司，批号8117203）；无支原体新生牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号180709）；四甲基偶氮唑蓝（MTT，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号JT343）；二甲基亚砜（DMSO，天津市化学试剂批发公司，批号20180408）；碘化丙啶（索莱宝科技有限公司，1mg/mL，批号20170518）；实验用Bcl-2、Bax和Cleavedcaspase-3抗体（上海碧云天生物技术有限公司，批号201712013、201808010、201707009);RNaseA（索莱宝科技有限公司，10mg/mL，批号20170504);AnnexinV-FITC凋亡试剂盒（天津优抗生物技术有限公司，批号UAFP050）。

1.2仪器

J810R离心机（德国Eppendorf公司）；HEPAclass100恒温培养箱（美国Thermo公司）；IM倒置显微镜（日本Olympus公司）；S3e流式细胞分选仪（Bio-RadLaboratories公司）；BDFACSCantoⅡ流式细胞仪（BD公司）。

1.3细胞株

人非小细胞肺癌细胞株NCI-H1975由天津医科大学肿瘤医院提供，常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2培养箱及饱和湿度条件下培养，2～3d传代1次。

2、方法

2.1尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞增殖的影响

取对数生长期的NCI-H1975细胞，接种于96孔培养板中，调整细胞浓度为1×105/mL，每孔100μL，设对照组（培养基中加入NCI-H1975细胞，不加药物）、尼美舒利组（100、200、300、400、500μmol/L）、吉西他滨组（20、40、80、160、320nmol/L），尼美舒利联合吉西他滨用药组（100+20、300+20、300+40、300+80、300+160）均设置8个复孔。继续培养24h，每组终止培养前加30μLMTT(5g/L），继续培养3～4h后弃上清液，加100μLDMSO溶解，避光震荡15min，使用酶标仪测定490nm波长处各孔的吸光度（A）值，重复3次，计算细胞的抑制率。以样品浓度对数值与抑制率（IR）做回归方程，求出尼美舒利对NCI-H1975细胞作用不同时间的半抑制浓度（IC50）值。

2.2流式细胞术检测尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞周期的影响

取对数生长期的NCI-H1975细胞，调整密度为1×105/mL的细胞悬液，接种于25cm2培养瓶中，贴壁24h后，分别加入尼美舒利100μmol/L、吉西他滨20nmol/L和尼美舒利100μmol/L+吉西他滨20nmol/L，另设不加药物的对照组。置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，孵育48h后，用胰酶消化，1000r/min离心5min收集细胞。用冷PBS洗涤2次，离心，用70%冰乙醇溶液，4℃固定细胞24h。1000r/min离心5min，弃掉乙醇固定液。再用PBS洗涤2次后将细胞重悬于PBS中。加入终浓度为50μg/mLRNaseA,37℃水浴30min，加入终浓度为20μg/mL碘化丙啶，避光，室温孵育15min，流式细胞仪检测各组细胞生长周期。

2.3流式细胞术检测尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞凋亡的影响

取对数生长期NCI-H1975细胞调整密度为1×105/mL的细胞悬液，接种于25cm2培养瓶中，贴壁24h后，分别加入尼美舒利100μmol/L、吉西他滨20nmol/L和尼美舒利100μmol/L+吉西他滨20nmol/L，另设不加药物的对照组。置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，于药物作用48h后，收集细胞，用胰酶消化后，1000r/min离心5min收集细胞。用冷PBS洗涤2次，1000r/min离心5min，将细胞重悬于试剂盒配套的1×bindingbuffer缓冲液中，加入5μLAnnexinV-FITC和1μL100μg/mL的碘化丙啶溶液，轻轻混匀。避光、室温反应15min。上机测定细胞凋亡情况。

2.4Westernblotting法检测尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3表达的影响

NCI-H1975细胞接种于6孔板中，分组同上，培养48h后提取总蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后，将蛋白转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液封闭后，加入一抗Bcl-2(1∶500）、Bax(1∶500）、Cleavedcaspase-3(1∶500）。4℃孵育过夜；TBST缓冲液洗膜3次后与相应的二抗（1∶2000）室温孵育30min；再用TBST漂洗膜3次，加入发光液后显影、定影、拍照，实验重复3次。以目标条带与内参GAPDH的比值评价蛋白表达水平。

2.5统计学方法

用SPSS21.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，多组间差异用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD法（方差齐）或Dunnett’sT3法（方差不齐），另外增殖抑制率判断两药联用的拮抗、相加或协同效应，按金氏公式求q值，q>1.15表示两药联用有协同作用，q值为0.85～1.15表示两药联用具有相加作用，q<0.85表示两药联用具有拮抗作用。q=(Ea+b）/Ea+Eb-Ea×Eb,Ea+b为两药合用的抑制率；Ea和Eb为各药单用时的抑制率。

3、结果

3.1尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞增殖的抑制作用

尼美舒利的IC50为（298.76±2.79）μmol/L和吉西他滨的IC50为（78.64±3.14)nmol/L，二者单独用药时对NCI-H1975细胞均有明显的抑制作用，且药物剂量与细胞抑制率呈正相关。尼美舒利和吉西他滨联用时对NCI-H1975细胞就呈现出了更强的抑制作用，与单独用药相比差异具有统计学意义（P<0.05且q>1.15），表明两种药物联合应用对抑制NCI-H1975细胞增殖具有协同作用。当用尼美舒利为300μmol/L与不同浓度吉西他滨联用时，其抑制率与两倍浓度的吉西他滨接近或更高，说明尼美舒利联合吉西他滨可降低吉西他滨的用量。见表1。

3.2尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞周期的影响

根据细胞增殖的结果，选择低于IC50剂量的药物浓度即尼美舒利100μmol/L和吉西他滨20nmol/L，单独用药或联用作用于NCI-H1975细胞。流式细胞术检测结果表明，与对照组相比，尼美舒利+吉西他滨组和单药组细胞G0/G1比例均明显升高（P<0.05),S和G2/M比例降低（P<0.05),NCI-H1975细胞的生长周期被阻滞在G0/G1期，且联用组比单用药组作用更明显（P<0.05）。见图1、表2。

3.3尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞凋亡的影响

根据细胞增殖的实验结果，选择低于IC50剂量的药物浓度即尼美舒利100μmol/L和吉西他滨20nmol/L，单独用药或联用作用于NCI-H1975细胞。流式细胞术检测结果表明，与对照组比较，尼美舒利+吉西他滨组和单药组均可显著诱导NCI-H1975细胞凋亡（P<0.05），且与单药组相比，联合用药组诱导NCI-H1975细胞凋亡的作用更明显，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图2、表3。

3.4尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3表达的影响

根据细胞增殖的实验结果，选择低于IC50剂量的药物浓度即尼美舒利100μmol/L和吉西他滨20nmol/L，单独用药或联用作用于NCI-H1975细胞。Westernblotting法检测结果表明，与对照组比较，尼美舒利+吉西他滨组和单药组均可显著升高Bax、Cleavedcaspase-3的表达量（P<0.05），显著降低Bcl-2的表达量（P<0.05）；且与单药组相比，联合用药组能明显下调Bcl-2蛋白表达（P<0.05），上调Bax和Cleavedcaspase-3蛋白表达，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图3、表4。

表1尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞增殖的抑制作用（x±s,n=6)

图1细胞周期分布图

表2尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞周期的影响（x±s,n=3)

图2尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞凋亡的影响

4、讨论

非甾体抗炎药（NSAIDs）是一类不含有甾体结构，具有抗炎、解热、镇痛作用的药物。近年来，各种临床及实验研究显示长期有效地服用NSAIDs能够降低肿瘤的发生率。大量的实验研究还证实选择性COX-2抑制剂的抗肿瘤作用尤为突出。COX-2在肿瘤中的作用机制主要有：COX-2可促进肿瘤细胞的增殖，抑制细胞的凋亡；促进肿瘤细胞的侵袭，提高肿瘤细胞转移的可能性，还可诱导肿瘤新生血管形成。因此COX-2抑制剂的抗肿瘤作用成为研究热点[7,8,9,10]。吉西他滨是目前治疗中晚期肺癌的常用药物之一，但由于其半衰期短、靶向性不强、毒副作用大在体内容易代谢失活等问题限制了其临床应用[11,12,13,14]。同时大剂量药物的使用也容易造成肿瘤细胞对化疗的抵抗[15]，因此联合应用一些辅助治疗药物降低吉西他滨的使用剂量，提高肺癌细胞对吉西他滨的敏感性是提高化疗效果并改善患者顺应性的有效方法。

图3尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3表达的影响

表4尼美舒利联合吉西他滨对NCI-H1975细胞Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3表达的影响

本研究选择NCI-H1975细胞为研究对象，研究了尼美舒利联用吉西他滨对NCI-H1975细胞的抗肿瘤增敏作用。尼美舒利抑制肿瘤的作用与剂量有关，而无论是高浓度吉西他滨还是高浓度的尼美舒利都会使抑制率升高，不利于观察两药的协同作用，因此本研究选用了低浓度的尼美舒利100μmol/L联合低浓度的吉西他滨20nmol/L作用于细胞，采用MTT法对两药单独使用和联合使用抑制NCI-H1975细胞增殖作用进行了检测。结果显示尼美舒利与吉西他滨联用时，对NCI-H1975细胞的生长抑制明显高于单药组，且两药具有协同作用，与浓度呈正相关。当固定尼美舒利用量时达到相同的抑制率，所需吉西他滨的量是单用吉西他滨剂量的1/3左右，说明尼美舒利联合吉西他滨不仅可以提高其杀伤细胞的作用，还可降低吉西他滨的用量，进一步降低了吉西他滨的毒性。

本研究还观察了用药前后细胞周期分布和细胞凋亡的变化情况，100μmol/L尼美舒利与20nmol/L吉西他滨联用G0/G1期细胞比例明显升高（P<0.05),S期和G2/M期细胞比例降低（P<0.05），差异具有统计学意义。说明两药联用将NCI-H1975细胞的生长周期阻滞在了G0/G1期。同时两种药物均可诱导细胞凋亡，吉西他滨单独用药细胞凋亡率为35.7%，两种药物联用细胞凋亡率为58.3%，升高了近1倍。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡因子，而Bcl-2是抗凋亡因子，它们都与肿瘤细胞凋亡密切相关，有研究表明，激活Bcl-2/Bax信号通路，可加速肺癌细胞的凋亡[16]。Caspase家族是凋亡过程的核心调控因子，而caspase-3是凋亡的效应因子。尼美舒利和吉西他滨联用通过抑制Bcl-2蛋白的表达，激活Bax和Cleavedcaspase-3蛋白的表达，来促进细胞凋亡，联用组与单药组相比，降低Bcl-2蛋白的表达有显著性差异，Bax和Cleavedcaspase-3蛋白的表达水平升高同样有显著性差异。其作用机制可能是激活Bcl-2/Bax信号通路，活化Cleavedcaspase-3，最终诱导了肺癌细胞的凋亡。同时尼美舒利可用于慢性关节炎症、手术和急性创伤后的疼痛、发热等症状，这样两药联用既可对吉西他滨具有增敏作用，又可降低吉西他滨用药剂量，减少毒性，同时又能缓解肿瘤患者的一些其他症状，增加患者顺应性。因此提示临床当一些肿瘤患者在化疗的同时使用尼美舒利时，应注意化疗药物的用量。

综上所述，尼美舒利联用吉西他滨体外抑制NCI-H1975细胞的增殖，将细胞周期阻滞在了G0/G1期，并促进了细胞的凋亡，其作用机制可能与下调Bcl-2蛋白，上调Bax和Cleavedcaspase-3蛋白的表达有关。因此尼美舒利可能成为一种潜在的治疗肺癌的药物，它通过与吉西他滨的协同抗肿瘤作用，来降低吉西他滨的使用剂量，进一步限制其毒性及延缓其耐药性的产生。

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