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外周血循环肿瘤细胞在晚期非小细胞肺癌患者化疗前后的计数与预后关系分析

2020-09-04 298 上传者：管理员

摘要：目的：探讨晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者化疗前后是否可检测到循环肿瘤细胞(CTCs)计数以及CTCs计数是否可提供预后信息或作为对化疗反应的预测生物标志物。方法：选取2016年5月至2019年5月本院新诊断或复发的晚期NSCLC患者41例作为研究对象，所有患者均在化疗前采集2mL静脉血，采用过滤装置捕获外周血中的CTCs，并采用免疫荧光染色对捕获到的CTCs进行识别与鉴定。结果：患者中位无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)分别为6个月和14个月。化疗前CTCs计数>6个，是PFS降低(P=0.007)和OS降低(P=0.007)的显著预测指标。结论：化疗前CTCs计数是晚期NSCLC的独立预后因素，且CTCs计数>6个的患者预后不良。

关键词：
化疗反应
循环肿瘤细胞
总生存期
无进展生存期
非小细胞肺癌
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肺癌是全球高发病率及高死亡率的癌症之一，据统计，每年全球新发肺癌患者高达160万人[1]。原发性肺癌恶性程度高，临床70%的患者确诊时已处于局部晚期或全身转移，错过最佳手术治疗机会，5年生存率<20%[2,3]。非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌患者的80%，由于非小细胞肺癌患者早期临床症状不明显，就诊时大部分患者已发生局部或全身转移，包括脑、骨、肝和肾上腺的远处转移，导致患者死亡率高，预后差[4,5,6]。本研究旨在探讨晚期非小细胞肺癌患者化疗后循环肿瘤细胞计数与预后的关系，以及与无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）的关系，现报道如下。

1、资料与方法

1.1 临床资料

选取2016年5月至2019年5月本院新诊断或复发的晚期NSCLC患者41例作为研究对象。根据国际肺癌研究学会（IASLC）制定的第八版国际肺癌TNM分期标准进行分期[4]。本研究经医学伦理委员会审核批准。纳入标准：TNM分型包括Ⅲ期和Ⅳ期的所有NSCLC患者；患者的东部肿瘤协作组（ECOG）评分为0分或1分，且可耐受全身化疗；所有患者均接受一线铂类化疗；患者知情同意并签署知情同意书。排除标准：TNM分期为Ⅲ期和Ⅳ期的NSCLC患者但不能接受化疗；ECOG评分为3分或4分的患者。

1.2 方法

1.2.1 临床与实验室评估

化疗前，患者均接受标准的临床和实验室评估，包括胸腹部增强计算机断层扫描（CT）、头部增强磁共振成像和骨ECT，并在治疗中每隔2个周期通过影像学检查进行肿瘤评估，或在怀疑疾病已经发生进展时对肿瘤进行CT评估。通过实体瘤中的响应评估标准（RECIST）评估疾病状态。PFS定义为从采血到患者疾病进展或其他原因死亡所经过的时间，OS定义为从采血到患者死亡或末次随访时间。

1.2.2 CTCs的分离和计数

按照ChenJ等[7]的方法分离和计数CTCs。首先，在含有EDTA的收集管中收集2mL外周血，标本无需任何处理，直接进行上样。在捕获分离完成后，在该装置中进行免疫荧光染色。首先通过使用4%多聚甲醛固定捕获的细胞20min,PBS缓冲液洗涤后，用0.2%TritonX-100处理细胞10min。透化后，将细胞用PBS缓冲液再次洗涤；随后将细胞用3%BSA溶液进行封闭处理30min。然后用AlexaFluor555(1.0μg/mL,ThermoFisher）标记的抗细胞角蛋白（2.0μg/mL,ThermoFisher）的染色溶液进行染色40min。用PBS缓冲液进行漂洗，最后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI,ThermoFisher）将细胞核染色10min。最后在荧光倒置显微镜（OLYMPUSIX51)上观察并进行计数，并用Image-Pro软件记录荧光图像并用ImageJ分析处理，见图1。

图1CTC的荧光图像

1.3 统计学方法

不同临床特征和CTCs计数的相关性比较采用检验，使用Kaplan-Meier生存曲线绘制患者的PFS和OS生存曲线，并通过秩和检验进行组间生存比较，对CTCs计数和临床特征进行单变量Cox比例风险回归分析，以确定其是否与PFS和OS相关。在多变量Cox回归分析中仅包括通过单变量分析与PFS和OS显着相关的临床因素。统计分析使用SPSS20.0和GraphPadPrism7，免疫荧光图像处理使用PhotoshopCS6和ImageJ进行处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 患者基本临床特征及基线CTCs计数与OS和PFS之间的关系

所有患者均接受标准化疗：14例接受吉西他滨联合顺铂治疗，22例接受培美曲塞联合顺铂治疗，2例接受多西紫杉醇加顺铂治疗，2例接受紫杉醇和卡铂治疗，1例接受长春瑞滨加顺铂治疗。41例患者中有37例患者死亡，4例患者存活，采用CTCs的中位数作为临界值，患者分为CTC>6个和CTC≤6个。41例患者的中位生存期（OS）为14个月。在单变量Cox回归分析中，与生存期显著相关的临床特征为发生远处转移及CTC计数。41例患者的中位PFS为6个月，单变量Cox回归分析中，CTC计数与远处转移与PFS显著相关，在多变量Cox风险回归分析中，基线CTC计数是OS和PFS的有效预测指标，见表1、图2。

表1影响肺癌患者总生存期的单因素及多因素分析

图2肺癌患者总生存期（OS）无进展生存期（PFS）的Kaplan–Meier生存曲线

3、讨论

本研究结果表明，非小细胞肺癌患者基线CTCs计数与T细胞远处转移与PFS显著相关，即发生远处转移的患者，且高CTC计数是预后不良的主要因素。表明，基线CTCs计数可作为晚期NSCLC患者预后评估的标志物，且与PFS和OS存在显著的相关性[8]。但本研究存在局限性，首先，这仅是一项针对晚期NSCLC患者，无法有效评估早中期NSCLC患者。其次，仅有NSCLC患者参与研究，样本量小可能会导致结果偏倚。最近新兴的“液体活检”技术，包括循环肿瘤细胞（CTC），循环肿瘤DNA(ctDNA）和细胞外囊泡（EV）和外泌体在内的液体活检技术可改变癌症管理和治疗方式，患者血液中的循环生物标记物的发现可以较少侵入性的方式诊断非血液学癌症,其比传统肿瘤活检测方式更实用，液体活检基本上呈现来自原发或远处肿瘤位置的疾病形态，并且肿瘤标志物的可重复取样，并可根据患者对治疗的反应调节治疗方式,因此，其称为个体化或精确治疗[9]。其中最具代表性的为循环肿瘤细胞（CTCs）。

综上所述，基线CTC计数是晚期NSCLC患者的独立预后因素。

参考文献：

[2]支修益,杨跃,王长利.原发性肺癌诊疗规范(2015年版):外科部分[J].中国医学前沿杂志,2015,7(2):28-31.

[3]任冠华,范亚光.低剂量螺旋CT肺癌筛查研究进展[J].中国肺癌杂志,2013,16(10):553-558.

[4]高文静,黎灼滔,钟方毅,等.血清CEA和CYFRA21-1对非小细胞肺癌的诊断价值[J].当代医学,2014,20(8):111-112.

[5]李丹波.培美曲塞与多西他赛在晚期非小细胞肺癌靶向治疗失败后挽救化疗中的疗效分析[J].当代医学,2019,25(22):144-146.

李昂,何晓东,沈佐君.晚期非小细胞肺癌患者化疗前后的外周血循环肿瘤细胞计数与预后的关系[J].当代医学,2020,26(25):126-127.