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抑制人结直肠癌细胞系SW480增殖和迁移的分泌型卷曲相关蛋白2

2020-09-05 513 上传者：管理员

摘要：目的：探究分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)抑制人结直肠癌细胞系SW480增殖、迁移的分子机制。方法：在人正常结肠上皮细胞HCoEpiC和结直肠癌细胞系SW480中采用Westernblot和RT-qPCR检测SFRP2的表达;构建shSERP2稳转SW480细胞株;在shNCSW480和shSFRP2SW480细胞中采用Westernblot和RT-qPCR检测SFRP2、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和Twist的表达;HIF-1α抑制剂(IDF-11774)刺激shSFRP2SW480细胞后,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell小室法检测细胞迁移、侵袭。结果：SW480细胞中SFRP2的表达量低于HCoEpic细胞(P<0.01);敲降SFRP2后,SW480细胞增殖、迁移、侵袭能力显著提高(P<0.001);而细胞内HIF-1α和Twist表达水平显著提高(P<0.01);HIF-1α抑制剂(IDF-11774)刺激后,其增殖、迁移、侵袭能力显著回降(P<0.001)。结论：SFRP2通过调控HIF-1α-Twist信号轴发挥其抑癌作用。

关键词：
Twist
低氧诱导因子1α
分泌型卷曲相关蛋白2
癌细胞
结直肠癌
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结直肠癌(colorectalcancer)作为常见的消化道恶性肿瘤之一,近几年发病率逐渐增高。仅2014年中国结直肠癌新发病例就有79180例,病死率高达13.27/10万[1]。其中癌细胞的转移是致死的主要原因[2]。因此,探索结直肠癌细胞转移的分子机制有望为其治疗提供有效的靶点。

分泌型卷曲相关蛋白2(secretedfrizzled-relatedprotein2,SFRP2)作为SFRP家族成员之一,三维结构中存在一个富含半胱氨酸的结构域,与Wnt配体高度同源,因此可以作为拮抗剂抑制Wnt/β-catenin信号通路[3]。SFRP2在一些恶性肿瘤中的表达失调已被报道,但是它在这些癌中的作用机制不尽相同。比如,在骨肉瘤[4]、肾癌[5]和乳腺癌[6]中呈现高表达具有促癌作用;然而,在胃癌[7]、结直肠癌[8]、口腔鳞癌[9]中,SFRP2高甲基化导致其表达下调,被认为具有抑癌作用。目前大多数学者只关注于SFRP2甲基化在结直肠癌检测中的应用,其抑癌的具体分子机制尚不清楚。本文通过检测SFRP2在结直肠癌细胞的表达,分析其对结直肠癌细胞系SW480增殖、迁移、侵袭的影响。

1、材料与方法

1.1 材料

人正常结肠上皮细胞系(humannormalcolonicepithelialcellline)HCoEpiC、结直肠癌细胞系(humancolorectalcancercellline)SW480和人胚胎肾上皮细胞系HEK293T(美国典型培养物保藏中心);RPMI1640和DMEM培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素(ThermoFisherScientificals公司);慢病毒包装试剂盒(Origene公司);CCK-8、BCA试剂盒(北京碧云天生物公司);SFRP2、低氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α)、Twist抗体(Abcam公司);IDF-11774(Selleck公司);FastKing一步法反转录-荧光定量试剂盒(北京天根生化科技有限公司);超低温高速离心机[SIGMA(3K15型)]。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养:

将HCoEpiC和SW480培养于含10%胎牛血清,1%青霉素、链霉素的RPMI1640培养基中。培养条件:37℃,5%CO2。每隔2d更换新鲜培养基。HEK293T细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,培养条件同上。

1.2.2 RT-qPCR检测mRNA水平:

取处于对数增殖期细胞,采用RNA提取试剂盒提取RNA,Nanodrop测量260/280处吸光度值。取1μgRNA作为模板,采用FastKing一步法反转录-荧光定量试剂盒检测mRNA水平,以GAPDH作为内参。每组实验设置3个复孔。mRNA表达量比较采用2-△△Ct计算,其中Ct=△Ct目的-△Ct内参,△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组。引物由上海生工合成。SFRP2上游引物:5′-GGAGACCAAGAGCAAGACCAT-3′,下游引物:5′-GCACTGCAAGCTGTCTTTGA-3′;β-catenin上游引物:5′-TACTGTCCTTCGGGCTGGTG-3′,下游引物:5′-CGGGTATCCTGATGTTGCGC-3′;Snail上游引物:5′-GGCTCCTTCGTCCTTCTCCTCTAC-3′,下游引物:5′-CCAGGCTGAGGTATTCCTTGTTGC-3′;HIF-1α上游引物:5′-TGCACAGGCCACATTCACGTA-3′,下游引物:5′-GTTCACAAATCAGCACCAAGCA-3′;Twist上游引物:5′-CGGCCAGGTACATCGACT-3′,下游引物:5′-CCATCCTCCAGACGGAGA-3′;GAPDH上游引物:5′-CTGACTTCAACAGCGACACC-3′,下游引物:5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′。

1.2.3 Westernblot检测蛋白水平:

取处于对数增殖期的细胞,加入含有1μmol/LPMSF的RIPA裂解液,冰上裂解30min。12000r/min,离心30min,收集上清。采用BCA试剂盒测定总蛋白浓度,取50μg蛋白上样于分离胶为12%的SDS-PAGE上,160V恒压1h。湿转法恒流250mA转移至PVDF膜上,5%的脱脂奶粉室温封闭1h;加入一抗[SFRP2(1∶1000);β-catenin(1∶1000);Snail(1∶1000);HIF-1α(1∶1000);Twist(1∶5000)]。4℃孵育过夜,PBST洗涤,二抗室温孵育1h。曝光显影。

1.2.4 构建敲减SERP2稳转SW480细胞株及分组:

首先将HEK293T细胞接种于6cm培养皿中,孵育过夜后,进行转染,步骤按照说明书操作。48h后,采用0.45μm的滤膜过滤收集含有慢病毒的细胞上清。同时,将SW480接种至6孔板中,待细胞汇合度达到70%,加入收集到的含有慢病毒的细胞上清,4d后,采用Westernblot和RT-qPCR检测SERP2的敲减效率。实验分组如下:1)shNC组,转染controlshRNA;2)shSERP2组,转染SERP2shRNA;3)shSERP2+IDF-11774组,转染SERP2shRNA的细胞,同时采用20μmol/LIDF-11774处理。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖能力:

将2×103个细胞接种于96孔板中,继续培养12、24和48h后,向每孔内加入10μLCCK-8溶液,孵育4h后,检测酶标仪450nm处的吸光度值。

1.2.6 Transell小室法实验检测细胞迁移、侵袭能力:

迁移:分别收集细胞,无血清培养液重悬,取5×104细胞接种于Transwell小室上层,下层加入600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,培养48h后,用棉签将上层小室内中的细胞擦去,结晶紫染色30min。倒置显微镜下观察细胞迁移数。侵袭:预先在Transwell小室上层铺一层Matrigel基质膜,其他同迁移实验。

1.3 统计学分析

采用GraphpadPrism7.0分析数据。计量数据采用均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,两两比较采用独立t或Mann-WhineyU非参数检验。

2、结果

2.1 SFRP2在结直肠癌细胞系SW480及结直肠癌组织中的表达

SW480细胞中SFRP2的转录和翻译水平显著低于HCoEpiC细胞(P<0.01)(图1A,B)。另外,生物信息学数据库GEPIA显示(图1C)癌组织中SERP2的表达水平低于癌旁组织(P<0.05)。

2.2 敲降SERP2后SW480细胞增殖、迁移、侵袭能力增强

与shNC组比较,shSFRP2组细胞中SFRP2的表达水平显著降低(P<0.01)(图2A,B);而增殖、迁移和侵袭能力显著提高(P<0.001)(图2C～E)。

图1SFRP2在结直肠癌细胞系SW480(A和B)及结直肠癌组织中的表达(C)

图2SERP2对SW480细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

2.3 HIF-1α和Twist在SW480细胞中的表达

与shNC组比较,shSFRP2组HIF-1α和Twist表达水平明显提高(P<0.01)(图3)。

2.4 HIF-1α抑制剂(IDF-11774)降低SERP2敲降对SW480细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响

与shSFRP2组比较,shSFRP2+IDF-11774组细胞增殖、迁移、侵袭能力显著降低(P<0.001)(图4)。

3、讨论

研究发现54.39%的结直肠癌患者血浆样本中SFRP2存在高度甲基化[10]。因此,目前认为SFRP2是结直肠癌的抑癌基因。但是其与结直肠癌发生、发展的分子机制尚未清楚。

本研究首先确定了SFRP2在结直肠癌细胞系SW480中表达量低于正常上皮细胞。初步表明SFRP2在结直肠癌中可能是抑癌基因。SFRP2在Wnt通路中起关键作用,在绒(毛)膜癌[11]、骨肉瘤[4]、乳腺癌[6]中SFRP2能够促进癌细胞的侵袭、转移,具有促癌作用。然而在卵巢癌中发现TET1可以通过激活SFRP2表达抑制癌细胞的上皮间质转化,提示SFRP2具有抑癌作用[12]。本文敲降SFRP2后,发现结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力显著提高,表明了SFRP2在结直肠癌中为抑癌基因。

β-catenin、Snail、Twist是与EMT相关的转录因子,过表达能促进肿瘤细胞的上皮间质转化,导致肿瘤细胞从原发部位脱落,向周边组织转移[13]。本研究发现敲降SFRP2后,Twist表达水平显著提高,而β-catenin、Snail的表达水平并未受到影响。所以推测SFRP2通过调控Twist的表达抑制结直肠癌细胞的转移。目前已证实HIF-1α可以通过激活Twist的表达促进结直肠癌的增殖侵袭[14]。另外研究还发现HIF-1α表达受Wnt/β-catenin信号通路调控[15],而SFRP2是Wnt配体的拮抗剂,因此推断SFRP2可能通过阻断Wnt/β-catenin信号传导来抑制HIF-1α表达,从而限制结直肠癌的进展。基于该推测,本文检测了HIF-1α在结直肠癌的表达,发现敲降SFRP2后,SW480细胞中HIF-1α表达水平显著升高。证实了在结直肠癌中SFRP2作为Wnt配体的拮抗剂首先抑制了HIF-1α表达,然后阻滞Twist激活,上皮间质转化受阻,最终控制了癌细胞的转移。紧接着,本文采用HIF-1α抑制剂(IDF-11774)刺激shSFRP2SW480细胞,发现IDF-11774可以降低SERP2敲降对SW480细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。进一步说明了SFRP2通过调控HIF-1α-Twist信号通路抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭。

图3HIF-1α和Twist在SW480细胞中的表达

图4IDF-11774对SW480细胞增殖(A)、迁移和侵袭能力(B和C)的影响

综上所述,SFRP2可以抑制结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭,可能是参与结直肠癌发生的负调控因子。后续可以尝试设计开发SFRP2激活剂用于结直肠癌治疗。

参考文献：

[1]王锡山.中美结直肠癌流行病学特征对比及防控策略分析[J].中华结直肠疾病电子杂志,2019,8:7-11.

[13]何昀,方姝煜,毕杨,等.Twist调控骨肉瘤细胞的增殖､迁移和侵袭[J].南方医科大学学报,2018,38:56-62.

周菁,李索妮.分泌型卷曲相关蛋白2抑制人结直肠癌细胞系SW480的增殖和迁移[J].基础医学与临床,2020,40(09):1212-1217.

基金:陕西省重点研发计划项目(2017SF-080).