首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 肿瘤细胞论文 > miR-93-5p对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制

miR-93-5p对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制

2020-09-05 203 上传者：管理员

摘要：目的:研究miR-93-5p对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制。方法:运用qRT-PCR、Westernblot检测甲状腺癌细胞SW579、人正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1中miR-93-5p、CCNG2的表达;将anti-miR-93-5p组(转染anti-miR-93-5p)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-CCNG2组(转染pcDNA-CCNG2)、anti-miR-93-5p+si-con组(共转染anti-miR-93-5p和si-con)、anti-miR-93-5p+si-CCNG2组(共转染anti-miR-93-5p和si-CCNG2),均用脂质体法转染至SW579细胞;MTT法检测各组细胞的增殖;流式细胞术检测各组细胞的凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测各组细胞的荧光活性。结果:与人正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1相比,甲状腺癌细胞SW579中miR-93-5p表达显著升高,CCNG2表达显著降低(P<0.05);抑制miR-93-5p、过表达CCNG2均可抑制SW579细胞增殖,促进凋亡;miR-93-5p可直接抑制SW579细胞中CCNG2的表达,敲减CCNG2可逆转抑制miR-93-5p对SW579细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。结论:抑制miR-93-5p可抑制甲状腺癌细胞的增殖,促进凋亡,其机制可能与靶向负调控CCNG2有关,将可为分化型甲状腺癌的预防和治疗提供新靶点。

关键词：
CCNG2
miR-93-5p
增殖
甲状腺癌
加入收藏

甲状腺恶性肿瘤主要发生于滤泡上皮细胞和滤泡旁细胞,根据发生部位不同分别命名为甲状腺癌和甲状腺髓样癌,其中甲状腺癌比较常见,约占95%[1,2]。根据甲状腺癌的分化程度不同分为分化型甲状腺癌、未分化甲状腺癌,其中分化型甲状腺癌包括乳头状甲状腺癌和滤泡状甲状腺癌[3]。未分化甲状腺癌较罕见,但其致死率近100%。分化型甲状腺癌也有可能发展为未分化型甲状腺癌[4]。目前对于难治愈性的晚期甲状腺癌靶向化学药物治疗具有巨大潜力[5,6,7]。miRNA为19～25个核苷酸序列组成的短链非编码微小RNA,其通过结合靶基因的3'UTR干扰RNA转录和蛋白翻译,以在机体中参与各种疾病和肿瘤的病理生理过程[8,9]。miR-93-5p在分化型甲状腺癌中的作用及机制知之甚少。细胞周期蛋白G2(CCNG2)是细胞周期蛋白G的成员,但其可抑制细胞增殖,阻滞细胞周期,这与周期蛋白G的功能完全相反[10,11]。CCNG2在多种肿瘤中均出现表达异常降低,但其调控机制尚未十分清楚。本研究拟以甲状腺癌细胞SW579为研究对象,检测SW579细胞中miR-93-5p、CCNG2的表达,观察抑制miR-93-5p、过表达CCNG2、敲减CCNG2对SW579细胞增殖、凋亡的影响,揭示其机制可能与miR-93-5p靶向CCNG2有关,将为分化型甲状腺癌的靶向治疗提供依据。

1、材料与方法

1.1材料

人甲状腺癌细胞SW579、FTC-133、KAT-18、人正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1均购自美国ATCC;DMEM培养基、胎牛血清、MTT、胰蛋白酶均购自美国Sellect公司;CCNG2一抗(CCNG2多克隆抗体)、CCNG2二抗(兔抗人红外荧光标记的二抗)均购自艾美捷科技公司;LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司;PVDF膜购自德国罗氏诊断有限公司;SDS-PAGE试剂盒、ECL发光液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司;AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养

用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养人甲状腺癌细胞SW579、FTC-133、KAT-18和人正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1,置于37℃,5%CO2的培养箱中常规培养。

1.2.2细胞转染

将anti-miR-93-5p、anti-miR-NC、pcDNA、pcDNA-CCNG2、anti-miR-93-5p+si-con、anti-miR-93-5p+si-CCNG2按照脂质体LipofectamineTM2000说明书操作步骤要求转染至SW579细胞,分别标记为anti-miR-93-5p组、anti-miR-NC组、pcDNA组、pcDNA-CCNG2组、anti-miR-93-5p+si-con组、anti-miR-93-5p+si-CCNG2组,转染48h后,用qRT-PCR检测转染效率。转染成功后,用于后续试验。

1.2.3qRT-PCR实验

取适量对数生长期1.2.2各组细胞,遵照RNA抽提试剂盒说明书要求操作提取RNA,进行定量,然后按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书操作进行miR-93-5p和CCNG2检测。用2-△△Ct计算miR-93-5p和CCNG2的表达。miR-93-5p上游引物序列:5'-GAAGATCTACCTTCACTGAGAGGGTGGT-3',下游引物序列:5'-CGGAATTCACCAGACCCTTTTGAACGCC-3';CCNG2上游引物序列:5'-AGCTTGCAACTGCCGACTCA-3',下游引物序列:5'-TCGGCTAGGCATTTAGAAACCAAC-3'。

1.2.4Westernblot实验

收集1.2.2各组细胞,加入裂解液,冰上裂解30min。12000r/min离心10min,。取上清置于EP管,加入5×SDS上样缓冲液,沸水煮沸10min。电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜;5%脱脂奶粉将膜封闭2h,洗膜,加入Ⅰ抗,4℃过夜孵育,洗膜,加Ⅱ抗,4℃2h。加发光液,曝光。

1.2.5MTT实验

取适量1.2.2各组细胞,加入20μl5g/L的MTT溶液,培养4h,然后弃去上清,每孔加入150μlDMSO,震荡,使结晶溶解,在490nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞的增殖力与细胞活力成正比。

1.2.6AnnexinV-FITC/PI流式细胞术实验

将1.2.2各转染组细胞,用结合缓冲液500μl悬浮细胞,分别加入5μl的AnnexinV-FITC和PI,混匀,室温避光静置15min。采用流式细胞仪分析测定结果。细胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

1.2.7双荧光素酶报告基因检测实验

取适量对数生长期1.2.2各组细胞,按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作说明书要求进行操作,以psiCHECK2-CCNG2-3'UTRWT和psiCHECK2-CCNG2-3'UTRMUT的表达为对照,观察miR-93-5p对CCNG2表达的影响。

萤火虫荧光素酶引物信息:上游引物序列为5'-AAGGATCCAGGTGGCACTTTTCG-3',下游引物序列为5'-GAAAAATAAACAAAACGGGGTTCCGCGCAC-3';载体引物信息:上游引物序列为5'-CCGCTCGAGGGTCTTTTAACTTAACGTTG-3',下游引物序列为5'-ATAAGAATGCGGCCGCCGGTAAGATATTAGATGGAG-3',导入了XhoⅠ与NotⅠ内切酶酶切位点(下划线部分)。

1.3统计学处理

实验中所有数据均采用SPSS21.0软件进行分析。计量资料用均数±标准差(x¯±s)表示,多组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1miR-93-5p和CCNG2在甲状腺癌细胞中的表达

与人正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1相比,甲状腺癌细胞中miR-93-5p表达显著升高,CCNG2mRNA表达显著降低,CCNG2蛋白表达显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)(图1)。

2.2抑制miR-93-5p表达对甲状腺癌细胞SW579增殖的影响

与anti-miR-NC组相比,anti-miR-93-5p组SW579细胞中miR-93-5p表达显著降低,48、72h时细胞活性均显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.3抑制miR-93-5p表达对甲状腺癌细胞SW579凋亡的影响

与anti-miR-NC组相比,anti-miR-93-5p组SW579细胞的凋亡率显著升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)(图3)。

2.4CCNG2过表达对甲状腺癌细胞SW579增殖和凋亡的影响

与pcDNA组相比,pcDNA-CCNG2组SW579细胞中CCNG2蛋白表达显著升高,48、72h时细胞活性均显著降低,细胞凋亡率显著升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)(图4)。

图1miR-93-5p和CCNG2在甲状腺癌细胞和正常甲状腺细胞中的表达

图2抑制miR-93-5p表达对甲状腺癌细胞SW579增殖的影响

图3抑制miR-93-5p表达对甲状腺癌细胞SW579凋亡的影响

2.5miR-93-5p靶向CCNG2

运用miRcode数据库预测到miR-93-5p与CCNG23'UTR存在结合位点(图5A);双荧光素酶活性检测结果显示,与miR-NC组相比,miR-93-5p组WT-CCNG2细胞中荧光活性显著降低,MUT-CCNG2细胞中荧光活性不受影响(图5B);与miR-NC组相比,miR-93-5p组细胞中CCNG2表达显著降低,与anti-miR-NC组相比,anti-miR-93-5p组细胞中CCNG2表达显著升高(图5C-D),差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.6敲减CCNG2逆转了抑制miR-93-5p对SW579细胞的增殖抑制和凋亡促进作用

与anti-miR-NC组相比,anti-miR-93-5p组SW579细胞在48、72h时细胞活性均显著降低,细胞凋亡率显著升高;与anti-miR-93-5p+si-NC组相比,anti-miR-93-5p+si-CCNG2组SW579细胞在48、72h时细胞活性均显著升高,细胞凋亡率显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)(图6)。

图4CCNG2过表达对甲状腺癌细胞SW579增殖和凋亡的影响

图5miR-93-5p靶向CCNG2

图6敲减CCNG2逆转了抑制miR-93-5p对SW579细胞的增殖抑制和凋亡促进作用

3、讨论

甲状腺恶性肿瘤是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,其主要风险因素有碘缺乏、辐射、甲状腺炎和遗传[12,13]。此外,甲状腺癌受环境差异的影响,其在中国人的发病率是波兰人的10倍,且在中国的发病率呈逐年上升趋势[14,15]。目前我国针对甲状腺恶性肿瘤主要以手术切除为主,放化疗为辅,明显提高了患者的生存时间[16,17]。但仍有部分甲状腺癌患者发展成为未分化型甲状腺癌,因此探索新途径、寻找新靶点对晚期甲状腺癌的治疗具有重要意义。miRNA在肿瘤中的调控作用得到普遍认可[18,19]。miR-93-5p在除甲状腺恶性肿瘤外的很多癌症中均出现异常表达,如鼻咽癌、食管癌[20,21]。Yang等[22]在非小细胞肺癌的研究中发现,miR-93-5p下调显著抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭,双荧光素酶报告基因测定证明miR-93-5p直接与肿瘤抑制基因PTEN和RB1的3'非翻译区结合,提示miR-93-5p在非小细胞肺癌中上调并通过抑制PTEN和RB1发挥致癌作用。Hao等[23]研究证实,miR-93-5p在泪腺样囊性癌中表达升高,且可通过靶向抑制BRMS1L的表达,促进泪腺样囊性癌细胞迁移、侵袭和增殖。Elise等[24]运用miRNA图谱分析甲状腺癌中的差异miRNA发现,miR-93-5p在甲状腺癌患者血清中出现异常升高。本研究检测了甲状腺癌细胞SW579中miR-93-5p的表达发现,miR-93-5p在SW579细胞中高表达,这与Elise的研究结果相一致;进一步研究发现,抑制miR-93-5p可抑制SW579细胞增殖并促进凋亡;深入研究用双荧光素酶报告基因检测实验验证,miR-93-5p靶向负调控CCNG2的表达。

细胞周期调控是细胞增殖的核心部分,与细胞癌变有密切关系[25,26]。CyclinG是细胞周期蛋白家族的新成员,包括细胞周期蛋白G1和细胞周期蛋白G2[27]。研究报道,CCNG2为细胞周期进展的关键负调节因子,该基因有助于细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡信号[28]。崔晓峰[29]、Kim[30]、Choi[31]的研究均证实CCNG2在人类肿瘤组织中出现表达异常降低。Li等[32]在甲状腺癌的研究中发现,CCNG2在甲状腺癌组织中低表达,且与淋巴结转移、临床分期和预后差均相关,过表达CCNG2可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的表达,提示CCNG2可能通过促进CDK2的降解而在甲状腺癌中发挥作用。Wang等[33]在甲状腺乳头状癌的研究中运用MTT和FCM法发现,过表达CCNG2可抑制甲状腺乳头状癌细胞K1的增殖,促进凋亡,其机制与上调K1细胞中的肿瘤抑制基因p53的表达有关,提示CCNG2可通过提高p53蛋白表达水平,抑制K1细胞的增殖,促进其凋亡。本研究检测了甲状腺癌细胞SW579中CCNG2的表达发现,CCNG2在SW579细胞中低表达,且过表达CCNG2可抑制SW579细胞的增殖并促进凋亡,这均与前人的研究结果相吻合;深入研究发现,敲减CCNG2可逆转抑制miR-93-5p对SW579细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。

综上所述,抑制miR-93-5p可抑制甲状腺恶性肿瘤细胞的增殖,促进凋亡,其机制可能与靶向负调控CCNG2有关,为甲状腺恶性肿瘤的治疗提供参考依据。

参考文献：

[4]殷德涛,许建辉.甲状腺癌基础研究的几个热点问题[J].中华医学杂志,2015,95(12):885-887.

[29]崔晓峰,徐振明,张萍,等.CyclinG2基因在喉鳞状细胞癌中的表达及其临床意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2009,23(6):277-279.

李宗禹,徐金锴,赖婧玥,关昊,刘博,马建仓.miR-93-5p靶向CCNG2基因对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制[J].现代肿瘤医学,2020,28(19):3325-3330.