胶质瘤是常见的中枢神经系统恶性肿瘤,因其具有发病率高、恶性程度高、致残致死率和复发率高等特点,严重威胁患者的生命健康[1]。以往胶质瘤患者生存率很低,尽管近年来随着手术技术的提高及临床治疗手段的增加,其的生存率显著提高[2],但胶质瘤患者的预后仍然不佳,据报道中低级别胶质瘤患者5年生存率为30%～70%,而高级别的胶质瘤患者的中位生存时间仅为14个月左右,5年生存率低于3%[3]。因此,应进一步多方位阐明胶质瘤发生发展的相关机制,探索新的治疗靶点,已成为积极完善胶质瘤患者临床诊疗的重要策略。

微小RNA(miRNAs)是一类20～25个核苷酸的短链非编码RNA,近年来随着对miRNAs研究的不断深入,其作为基因表达网络中的关键调控因子,在细胞周期进展、细胞增殖与分化、细胞死亡和炎症、应激反应及肿瘤等领域中作用已越来越被被人们所熟知[4]。研究表明,miR-133a在多种肿瘤中表达降低且在这些肿瘤中其发挥着抑制肿瘤生长的作用[5],如KAWAKAMI等[6]发现在肾癌细胞过表达miR-133a后,其可通过靶向调控TAGLN2来抑制肾癌细胞的增殖及侵袭,并诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期的进展。CHENG等[7]发现,在胃癌组织中低表达的miR-133能够通过靶向调控CDC42/PAKs信号通路来抑制胃癌细胞的增殖、侵袭及转移,且miR-133a的低表达与患者的不良预后高度相关。研究发现表观遗传学机制如DNA甲基化在miRNAs的表达调节中发挥着重要作用,尤其在肿瘤抑制性miRNAs基因的启动区的CpG岛的高甲基化是肿瘤发生过程中抑癌miRNA表达降低的最常见机制之一[8]。鉴于目前尚无miR-133a在胶质瘤中的相关报道,本研究预通过对比miR-133a在胶质瘤患者与正常对照人群中的表达差异,并进一步探究其在胶质瘤细胞中的表达调控机制及其对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响,以更好地阐明miR-133a在胶质瘤发生发展中的作用。

1、材料与方法

1.1材料

选取2018年08月至2019年08月于我院神经外科行手术切除的6例胶质瘤组织且所有胶质瘤组织样本均经临床诊断及术后病理学证实,其中男性3例,女性3例,平均年龄(52.3±6.9)岁。胶质瘤组织学诊断根据2016年WHO中枢神经系统肿瘤分级标准[1]。胶质瘤患者纳入标准为:首发病例;术前未接受放、化疗及其他治疗。对照组6例取自同期脑外伤颅内减压切除的脑组织,男性3例,女性3例,平均年龄(52.8±7.4)岁。两组患者性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。标本切除后立即置于液氮中保存,30min内转移至-80℃冰箱。本研究获得我院伦理委员会批准,研究对象的样本及资料采集均取得患者知情同意并签署知情同意书。

1.2细胞系及主要试剂

正常胶质细胞株HEB及胶质瘤细胞株U251、U87、A172均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。DMEM/HG、PBS、0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司);胎牛血清(FBS)(杭州四季青);Trizol试剂(Thermo公司)5-杂氮-2'-脱氧胞嘧啶(AZA),MTT(Sigma公司);SYBRGreenReal-timePCR(上海康为世纪);DNA提取试剂盒(TIANGEN生物公司);甲基化试剂盒(ZymoResearch公司);AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒(江苏碧云天);质粒提取试剂盒(美国Axygen公司);MSP所需试剂(TaKaRa公司);BSP所需试剂及测序(上海生物工程公司)。

1.3方法

1.3.1细胞的培养及药物处理

常规复苏HEB、U251、U87、A172细胞后,含有10%FBS的DMEM/HG常规培养液置于37℃、5%CO2恒温培养箱中进行培养,待细胞生长融合至70%～80%时用0.25%的胰酶进行消化,室温下800r/min×5min,弃上清,DMEM/HG培养基重悬细胞后进行传代。取处于对数期的HEB、U251、U87、A172细胞,常规消化后,用终浓度为10μmol/LAZA的常规培养液处理细胞72h用于后续实验,用含相同浓度的DMSO与上述四株细胞进行共培养作为对照组。

1.3.2MSP及BSP检测

miR-133a基因的甲基化水平按DNA提取试剂盒说明书方法提取胶质瘤组织及癌旁组织及3株胶质瘤细胞和正常胶质细胞株的基因组DNA,紫外分光光度计检测DNA的纯度及浓度后,按照甲基化试剂盒说明书方法进行基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰。MSP引物:miR-133a甲基化引物上游:上游5'-GGTTGTTTGTTTTTTGGTTCG-3',下游5'-ATCCTAAAACTACCCAAAATCGTA-3';非甲基化引物为:miR-133a上游5'-GGGATGAGGATTAGGATTTT-3',下游5'-CAAACAAAACACAATAAAAACAAACA-3'。反应条件为:94℃预变性(3min)→94℃变性(30s)→去甲基化53℃(30s)→72℃延伸(90s),35个循环后再94℃继续延伸5min。其中用H2O设置为阴性对照组,用M.SssⅠ酶处理的胶质瘤组织基因组DNA设置为阳性对照组。取扩增产物于含有EB的2%的琼脂糖凝胶中进行电泳。最后应用凝胶成像系统进行拍照。如应用甲基化引物扩增出产物则表示待测基因组存在DNA甲基化,若用非甲基化引物扩增出产物则表示不存在DNA甲基化,若均扩增出产物即为部分甲基化。Ct法计算各组细胞中miR-133a基因甲基化水平。BSP引物:miR-133a上游:5'-AGTTAAGAGTAGTGGGGAGATTAA-3',下游:5'-AAATTTTTTTTCTTTATTTACCCC-3'。应用BSP引物对待测样本的DNA进行PCR扩增。凝胶电泳进行验证。将胶回收的PCR产物于pMD19-T进行连接,取10μL连接产物转化为DH5感受态细胞,接种于预先铺有X-gal/IPTG与Amp的琼脂平板中,37℃孵育过夜。蓝白斑筛选3个白色斑的细胞克隆接种于2.5mL的LB液体培养基中,37℃培养过夜。质粒提取试剂盒提取质粒并送至上海生物工程有限公司进行测序,最后采用UltraEditPreofessionalText/HexEditor进行序列分析。

1.3.3RT-PCR检测miR-133a的表达

采用Trizol法提取细胞总RNA,分光光度计检测纯度与浓度后,根据逆转录试剂说明书逆转录为cDNA。再按照RT-PCR试剂说明书及预实验确定的反应时间与温度进行实时定量,RT-PCR反应条件为:95℃(10min)预变性后,变性95℃(7s)→退火60℃(20s)→72℃(38s),40个循环周期。RT-PCR引物为:miR-133a上游引物为5'-GCCAAGCTGGTAAAATGGAA-3',下游引物为5'-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3';U6上游引物为5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3',下游引物为5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。以U6为内参,采用2-△△Ct方法分析相关基因的表达量。

1.3.4MTT检测细胞增殖

将HEB、A172、U251、U87细胞常规消化后接种至96孔板中,调整细胞密度至2×104个/孔,向每孔加入终浓度为10μmol/L的ZAZ作为实验组,对照组为加入等浓度的DMSO,于37℃、5%CO2恒温培养箱中共同培养72h后向每孔加入5mg/mL的MTT试剂20μL,培养箱中继续培养4h,弃除原培养液后,每孔加入150μL的DMSO溶液,室温下震荡10min使形成的紫色甲瓒结晶充分溶解。酶标仪于490nm检测每孔吸光度值(OD490),每组设置5个复孔,取平均值。

1.3.5AnnexinV-FITC检测细胞凋亡

常规消化HEB、A172、U251、U87细胞,300r/min×5min,弃上清,4℃预冷的PBS洗涤细胞2次,300r/min×5min,收集细胞沉淀,用195μLAnnexinV-FITC结合液重悬细胞,并调整细胞至7×105个/mL。并依次加入5μL的AnnexinV-FITC及10μL的碘化丙啶(PI)染色液,轻轻摇晃离心管以充分混匀后,室温下避光孵育半小时。300目滤膜过滤细胞团块后,进行流式细胞仪检测。实验单独重复3次。

1.4统计学分析

采用SPSS19.0和GraphPadPrism5.0进行统计分析,数据结果用(x¯±s)表示。采用单因素方差分析(one-wayANOVA)进行多组间分析,两组间比较采用独立样本t检验,计数资料比较采用χ2检验。显著性检验水准α=0.05,P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1miR-133a在胶质瘤组织中低表达

RT-PCR技术检测正常人脑组织和胶质瘤组织中miR-133a的表达,实验结果显示与正常脑组织相比,6例胶质瘤组织样本中miR-133a的表达显著降低(P<0.01,图1)。

图1miR-133a在胶质瘤组织中的表达降低

2.2MSP检测胶质瘤组织和胶质瘤细胞系甲基化水平

对6对胶质瘤组织样本与正常对照组织样本进行MSP实验,结果显示与H2O的阴性对照组织相比,6个胶质瘤组织样本中有5个发生miR-133a基因甲基化(83.3%),6个正常对照脑组织中1个发生miR-133a基因甲基化(16.7%),这表明胶质瘤组织中miR-133a甲基化程度明显高于正常组织(P<0.01),见图2。

图2MSP检测6对胶质瘤组织与正常对照脑组织中miR-133a基因甲基化程度

2.3BSP检测正常胶质细胞系与胶质瘤细胞系miR-133a启动子区甲基化

BSP结果显示与正常胶质细胞HEB(22.3±4.77)%相比,胶质瘤细胞A172(86.4±7.51)%、U87(87.5±4.33)%、U251(88.1±8.39)%的miR-133a基因启动子区甲基化程度显著升高(P<0.01),见图3。

2.4去甲基化试剂AZA对miR-133a表达的影响

AZA与正常胶质细胞系HEB和三株胶质瘤细胞系U251、A172、U87共培养72h后,RT-PCR结果显示,与各细胞系的对照组DMSO相比,AZA处理后的A172、U87及U251细胞中miR-133a的表达水平显著增高,差异均具有统计学意义(P<0.01),而正常胶质细胞系HEB经ZAZ处理后,细胞中miR-133a的表达无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),见图4。

2.5去甲基化试剂AZA对胶质瘤细胞增殖的影响

MTT实验结果显示,与各细胞系的对照组DMSO相比,AZA处理的胶质瘤细胞系U251、A172及U87的增殖能力明显减弱(P<0.05),正常胶质细胞系HEB经ZAZ处理后,细胞中的增殖能力无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

图3BSP检测正常胶质细胞株与胶质瘤细胞株miR-133a基因甲基化程度

图4去甲基化试剂AZA对胶质瘤细胞中miR-133a表达的影响

2.6去甲基化试剂AZA对胶质瘤细胞凋亡的影响

细胞流式实验结果显示,与各细胞系对照组DMSO相比,AZA处理的胶质瘤细胞U251、A172及U87的凋亡发生率明显增加(P<0.05),而正常胶质细胞系HEB经ZAZ处理后,细胞中的凋亡发生率无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),见图5。

表1去甲基化试剂AZA抑制胶质瘤细胞的增殖能力

图5去甲基化试剂AZA促进胶质瘤细胞发生凋亡

3、讨论

胶质瘤是神经外科常见的恶性肿瘤,由于其所具有的恶性侵袭及转移等特点,使肿瘤组织与正常脑组织之间无明确界限,导致外科手术难以完全切除,且其对放化疗不甚敏感,极易导致肿瘤复发[9]。虽然近年来对胶质瘤发病机制的相关研究取得了一定的进展,但由于基因分子间复杂的调控网络,使得胶质瘤的恶性进展机制尚未完全阐明[10]。

近年来,随着肿瘤研究的不断深入,人们发现表观遗传调控在肿瘤的发病机制中具有重要的作用,尤其是DNA甲基化与miRNA的异常表达[8,11]。研究发现,许多miRNA基因内部或邻近的CpG岛发生异常甲基化是导致某些抑癌miRNA表达降低的重要机制[12,13,14]。如在骨肉瘤中,DNA甲基化通过下调miR-449c来促进其靶蛋白c-Myc的表达,而c-Myc又是调控细胞周期由G1期到S期的关键限速酶[15]。在肾癌中,CHEN[16]等发现在高度DNA甲基化的肾癌组织中,miR-766-3p的表达明显下降,进一步研究表明DNA甲基化可以抑制其表达,并通过促进miR-766-3p调控的目标蛋白SF2的上调来促进肿瘤细胞的增殖。在本研究中,我们通过RT-PCR检测胶质瘤组织与正常对照脑组织中miR-133a的表达,结果显示在胶质瘤组织中miR-133a的表达显著下降,应用MSP实验检测胶质瘤组织与正常对照脑组织中miR-133a基因的甲基化水平,结果表明与正常对照脑组织相比,胶质瘤组织中miR-133a的甲基化水平显著升高。这提示,在DNA甲基化可能是miR-133a在胶质瘤中表达异常降低的调控机制。采用正常胶质细胞株HEB与胶质瘤细胞株A172、U87、U251进行体外实验验证胶质瘤中DNA甲基化对miR-133a的调控作用并进一步探讨miR-133a对胶质瘤细胞的增殖、凋亡影响。BSP实验结果表明,与正常胶质细胞株HEB相比,胶质瘤细胞株A172、U87、U251中miR-133a基因甲基化水平明显增加。研究发现抑癌基因的异常表观调控具有一定的可逆性[12,17],鉴于此,我们应用去甲基化试剂AZA与胶质瘤细胞进行共培养,RT-PCR实验检测处理后的细胞中miR-133a的表达,结果显示与对照组相比,AZA处理后的胶质瘤细胞中miR-133a的表达显著增加,这进一步证实在胶质瘤细胞中,DNA甲基化抑制了miR-133a的表达。MTT增殖实验结果表明,去甲基化试剂AZA处理后的胶质瘤细胞增殖能力明显下降,AnnexinV-FITC凋亡实验结果显示,去甲基化试剂AZA处理后的胶质瘤细胞凋亡率显著增加,这表明在胶质瘤细胞中miR-133a可抑制肿瘤细胞的增殖并促进细胞发生凋亡。

综上所述,我们发现在胶质瘤细胞DNA甲基化通过调控miR-133a的表达而沉默后者发挥抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡的功能。本研究结果初步证实miR-133a是胶质瘤重要的抑癌miRNA,而DNA甲基化可能是调控其异常表达的主要机制。然而,上述作用机制可能仅仅是一个方面,有关miR-133a在胶质瘤中的其他具体作用,尚需进一步研究探讨。

参考文献：

[5]王玉洲,李金媚,杨志雄.miR-133a与肿瘤发生发展研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2016,30(4):313-315.

[9]房莉,章诗伟,李晶,等.脑胶质瘤患者预后影响因素分析[J].中国肿瘤,2014,23(12):1019-1023.

[11]胡小屏,路孟鑫,刘同族.肌动蛋白γ2对膀胱癌细胞迁移的抑制作用以及甲基化对其表达的调控作用[J].武汉大学学报(医学版),2019,40(04):546-551.

刘亮,朱正权,阿满·哈迪尔别克,杜山别克·克孜,夏海成,郑勇.DNA甲基化对miR-133a表达及胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响[J].现代肿瘤医学,2021,29(08):1296-1300.

基金:新疆维吾尔自治区自然科学基金(编号:2017D01C402)