食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是我国常见的恶性肿瘤，早期发现困难，恶性程度高[1,2]。手术切除是其主要治疗策略，放化疗为主的综合治疗为辅助治疗方式[3]。由于缺乏有效的靶向治疗药物，晚期ESCC临床疗效差，5年生存率<20%[4]。因此，探讨ESCC的分子靶点，寻找有效的靶向治疗药物，对ESCC的个体化精准治疗具有重要意义[5]。RICTOR全称雷帕霉素不敏感的mTOR伴侣(rapamycin-insensitive companion of MTOR,RICTOR )或者mTOR的RPTOR独立复合物2(RPTOR independent companion of MTOR complex 2,RICTOR)[6]。研究认为，RICTOR能够影响肿瘤细胞的生长、侵袭和骨架形成等功能[7,8,9]。然而，目前RICTOR在ESCC中的研究相对较少，RICTOR在ESCC增殖中的功能及机制尚不明确。因此，本研究拟通过体内外实验，分析RICTOR对ESCC细胞增殖能力的影响及其具体机制，并初步探讨靶向RICTOR的抗肿瘤效果，为ESCC的靶向治疗提供新的科学理论依据。

1、材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂与仪器

人ESCC细胞株KYSE30和KYSE150购自北京协和细胞库。RICTOR抑制剂JR-AB2-011购自美国MedChemExpress公司，转染试剂Lipo2000购自美国Sigma公司，Opti-MEM培养基购自美国Sigma公司，细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK8)购自美国Sigma公司。二氧化碳恒温培养箱MCO-15AC购自日本SNAYO公司，倒置显微镜CKX-41购自日本Olympus公司，多功能酶标仪ELX800购自美国Bio Tek公司，电泳仪EPS600及转移电泳槽VE-186购自中国上海天能科技有限公司，离心机5424R购自德国Eppendorf公司，全自动细胞计数仪TC20购自美国Bio-Rad公司，UV-1800型紫外可见分光光度计购自中国上海美谱达仪器有限公司。

1.2 实验动物

BALB/c裸鼠(SPF级，6只，雌性，5～6周龄，体质量18～20 g, 动物合格证号为RB2312225288)购自北京华阜康生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

KYSE30和KYSE150细胞系培养在含体积分数为10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 及体积分数为1%青-链霉素的RIPA1640培养基中，含体积分数为5% CO2、37 ℃条件下每2～3 d换液1次。当细胞生长至80%～90%汇合时，按1∶3传代。取生长状态良好，处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3.2 siRNA转染法敲降ESCC细胞系中RICTOR表达

转染前24 h将生长状态良好的KYSE30和KYSE150细胞转移至6孔板，确保转染时细胞生长密度至40%～60%。设计RICTOR的siRNA敲降序列siRNA1-RICTOR和siRNA2-RICTOR(5′-GCCUGCA- GACUCUAUGCAATT-3′和5′-GCUGAGAUUUCUC- UCCAUUTT-3′)。首先适量siRNA加入到250 μL Opti-MEM培养基中，轻柔混匀，室温孵育5 min, 使用转染试剂Lipo2000将其和siRNA混合，室温孵育20 min后加入培养基。继续培养6～8 h后更换培养基，检测敲降效率。分别构建KYSE30和KYSE150 细胞的siRNA-NC、siRNA1-RICTOR及siRNA2-RICTOR 3种细胞系。

1.3.3 慢病毒转染法构建KYSE30细胞系RICTOR稳定敲降细胞

RICTOR shRNA序列设计及合成由中国吉凯生物公司完成，具体序列为CCGGCGTCGGAGTAACCAAAGATTACTCGAGTAATCTTTG- GTTACTCCGACGTTTTTGAATT。将合成好的shRNA序列克隆至pLKO.1-EGFP-puro质粒构建慢病毒干扰质粒。本研究慢病毒包装系统分别由PLP1、PLP2和VSVG 3个质粒构成。将KYSE30细胞接种于6孔板，待长到60%密度时，使用构建好的病毒转染细胞，48 h后加入嘌呤霉素，筛选获得KYSE30稳定敲降RICTOR的shRNA-RICTOR细胞，设置shRNA-NC细胞为对照。

1.3.4 CCK8检测细胞增殖能力

将siRNA-NC、siRNA1-RICTOR及siRNA2-RICTOR细胞按照3 000个/孔细胞的数量铺于96孔板，各组设置12个复孔。将CCK8试剂与无血清培养基按照1∶10混合，按照每孔总量100 μL配置混合培养基，加入96孔板后继续孵育90 min, 酶标仪上机前轻轻拍打混匀，检测450 nm处光密度D值，绘制不同时间点细胞增殖曲线。

1.3.5 克隆形成实验

将siRNA-NC、siRNA1-RICTOR及siRNA2-RICTOR细胞接种于相应12孔板，每孔800个细胞，加入1 mL完全培养液。10～14 d后，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)清洗3遍，体积分数为4%多聚甲醛固定15 min, 结晶紫染色20 min, 凝胶成像仪拍照。

1.3.6 蛋白质印迹法检测蛋白表达

使用siRNA技术敲降ESCC细胞系中的RICTOR,获取蛋白后将待测细胞加入蛋白裂解液，冰上裂解5 min, 收集后震荡。4 ℃条件下5 000 r/min离心5 min(r=10 cm)。取裂解液上清即为待测蛋白溶液。采用BCA法测定蛋白浓度。行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后封闭。加入一抗(1∶5 000)4 ℃孵育过夜。TBST清洗3次，加入二抗(1∶5 000)孵育1 h。TBST清洗3次，化学发光液显影，进行图像分析。

1.3.7 裸鼠体内成瘤实验

胰酶消化KYSE30的shRNA-RICTOR及shRNA-NC细胞，PBS清洗3遍后计数，细胞密度调节至1×107/mL,置于冰上。将融化的基质胶与预冷的细胞悬液按1∶1混合注入注射器，4°转运。小鼠皮肤表面消毒，按照每只小鼠1×106个细胞的数量分别将shRNA-RICTOR及shRNA-NC细胞注入小鼠背部左右皮下，密切观察小鼠有无不良反应。细胞成瘤后，每周游标卡尺测量肿瘤大小。

1.3.8 药物抑制能力检测

将KYSE30和KYSE150细胞密度调整为1×104个/mL,按照3 000个/孔细胞的数量分别铺于96孔板。每株细胞均设置空白对照组与0.25 μmol/L浓度的JR-AB2-011药物实验组。细胞常规培养72 h后，采用CCK8试剂盒于酶标仪测定450 nm处光密度D值，分别计算药物实验组与空白对照组的细胞活性。

1.3.9 数据库分析

使用cBioPortal数据库(http: //www.cbioportal.org)分析RICTOR基因表达对患者生存的影响。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 5.0对数据进行统计学分析，数据绘图使用GraphPad Prism 5.0。计量数据采用Shapiro-Wilk(S-W)方法进行正态分布检验，2组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的数据以中位数(四分位间距)描述，组间差异比较采用非参数检验。检验水准α=0.05(双尾)。

2、结果

2.1 RICTOR对肿瘤患者预后影响

分析cBioPortal数据库28 646例患者数据，发现RICTOR拷贝数扩增等高表达患者生存率更差，P=0.013。RICTOR低表达患者中位总生存时间为83.93个月(95%CI:80.43～87.00,n=27 719),RICTOR高表达患者中位总生存时间为56.00个月(95%CI:49.25～67.80,n=927)。表明RICTOR可能扮演癌基因的角色，影响肿瘤患者预后。见图1。

图1 RICTOR表达对食管鳞状细胞癌患者预后的影响

2.2 敲降RICTOR对ESCC细胞体外增殖及克隆形成能力的影响

CCK8检测结果显示，敲降RICTOR基因后第96 h, KYSE30和KYSE150细胞系中，siRNA1-RICTOR和siRNA2-RICTOR细胞活性均降低，与siRNA-NC细胞比较差异均有统计学意义，均P<0.001。见图2和表1。

克隆形成实验结果显示，敲降RICTOR基因抑制了食管癌细胞的克隆形成能力。KYSE30和KYSE150细胞系中，siRNA1-RICTOR和siRNA2-RICTOR细胞克隆数量均降低，与siRNA-NC细胞比较差异均有统计学意义，均P<0.001。见表2。

图2 敲降RICTOR基因对食管鳞状细胞癌细胞体外增殖的影响

表1 CCK8实验检测敲降RICTOR基因对食管鳞状细胞癌细胞活性影响

表2 敲降RICTOR基因对食管鳞状细胞癌细胞克隆形成能力的影响

2.3 敲降RICTOR对ESCC细胞体内增殖能力的影响

体内实验结果表明，皮下接种后第5周，shRNA-NC及shRNA-RICTOR细胞成瘤后裸鼠肿瘤体积分别为(235.32±85.94)和(104.42±50.84) mm3,t=2.62,P=0.031。表明敲降RICTOR显著抑制了ESCC体内的增殖能力，靶向RICTOR靶点或可成为治疗ESCC的有效方法。见图3和表3。

图3 敲降RICTOR基因对食管鳞状细胞癌荷瘤鼠肿瘤体积的影响

表3 敲降RICTOR基因对食管鳞状细胞癌荷瘤鼠肿瘤体积的影响

2.4 敲降RICTOR对ESCC AKT磷酸化水平的影响

使用siRNA技术敲降细胞系中的RICTOR,蛋白质印迹法检测AKT磷酸化水平，结果显示，敲降RICTOR下调了下游p-AKT Ser473蛋白水平(图4)。表明在ESCC癌细胞系中，RICTOR或可通过促进肿瘤细胞AKT473磷酸化位点活化，进而促进肿瘤的恶性表型。

2.5 RICTOR抑制剂JR-AB2-011对ESCC细胞体外增殖能力的影响

使用RICTOR抑制剂JR-AB2-011抑制RICTOR分子活性，结果发现，在食管癌细胞系KYSE30 和KYSE150中，JR-AB2-011均具有较好的抑瘤效果，其在0.25 μmol/L浓度下细胞培养72 h, 与未使用抑制剂的空白对照组相比，抑制剂JR-AB2-011显著抑制了细胞增殖，均P<0.001。见表4。

图4 敲降RICTOR对AKT信号通路的影响

3、讨 论

尽管目前肿瘤的靶向治疗得到了较大发展，但由于ESCC缺乏有效的靶向治疗药物，其临床疗效并未明显提升[10],因此，探讨治疗ESCC新的治疗方法对基础及临床研究具有重要意义。肿瘤致癌基因的高表达往往正向调控肿瘤进展，而靶向高表达的癌基因或成为治疗肿瘤的重要方法[11]。本课题组前期通过胃食管交界处癌的测序数据分析和siRNA文库的高通量筛选及分子功能实验，已经鉴定出RICTOR是影响胃食管交界处癌细胞增殖能力最显著的驱动基因，发现了该基因在肿瘤进展中的重要功能[12]。此外，研究发现RICTOR同样在多种肿瘤中高表达，且高表达RICTOR的患者预后更差[13]。最近的一项研究表明，循环肿瘤DNA中的RICTOR变异与非小细胞肺癌患者的预后相关[14]。表明RICTOR在ESCC等多种肿瘤的发生发展中可能起到重要的促癌作用，值得进一步研究。

RICTOR是mTORC2复合物发挥功能和稳定性的关键分子，其高表达可活化多个下游磷酸化底物如PKA、PKG、PKC等蛋白激酶家族从而调控细胞存活和增殖[15]。研究表明，在结直肠癌和乳腺癌中RICTOR在癌组织中显著高表达，下调RICTOR可抑制细胞的增殖能力，促进细胞凋亡[16,17,18]。本研究发现，敲降RICTOR显著抑制了ESCC的增殖和克隆形成能力，与既往研究结论一致。体内实验验证了在裸鼠成瘤实验中，敲降RICTOR同样能够显著抑制ESCC体内的增殖能力。提示靶向RICTOR或可成为治疗肿瘤的有效方法[7,19]。相关研究认为，RICTOR参与的mTORC2信号通路与肿瘤的关系主要是由于其在激活AKT中的作用[20]。AKT中最重要的磷酸化位点为Ser473,其活化可以调控肿瘤的进展，包括细胞存活、增殖和代谢等，对肿瘤的发生发展有重要作用[21,22]。本研究进一步通过蛋白质印迹法发现在ESCC中RICTOR能够介导AKT Ser473的磷酸化，与既往研究结论一致。然而，在ESCC中RICTOR如何激活p-AKT Ser473尚不明确，有待进一步通过分子功能实验明确其确切的调控机制。

目前，靶向治疗作为一种新型治疗方法，已被证实在ESCC的治疗中发挥着重要作用，目前已经明确有效的靶点包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2 ,HER2)等[5,23,24]。此外，不少靶向致癌分子的新药正处于临床研究中[25,26]。有报道显示，RICTOR分子的特异性抑制剂JR-AB2-011在黑色素瘤中具有较好的抑制肿瘤转移能力[27,28],然而尚缺乏该抑制剂应用于ESCC等实体瘤的研究报道。因此，本研究探讨JR-AB2-011在ESCC中的功能，初步发现阻断RICTOR通路或可取得较好的抗肿瘤效果，其在0.25 μmol/L浓度下即可显著抑制ESCC细胞增殖。这提示靶向RICTOR可成为抗肿瘤的有效方法，JR-AB2-011或可成为ESCC的有效药物。

综上所述，本研究发现RICTOR与肿瘤患者预后相关，RICTOR敲降后显著抑制ESCC的增殖能力。进一步的分子功能实验显示RICTOR或参与AKT Ser473位点磷酸化介导肿瘤细胞的增殖活性。此外，本研究发现RICTOR分子的竞争性抑制剂JR-AB2-011在ESCC中具有较好的抗肿瘤效果，靶向RICTOR或可成为ESCC的治疗方法。针对RICTOR及下游通路设计相应的靶向治疗药物有望成为ESCC治疗的有效方法。

参考文献:

[2] 中华人民共和国国家卫生健康委员会医政医管局.食管诊疗指南(2022年版)[J].中华消化外科杂志,2022,21(10):1247-1268

[3] 文龙,张彬.食管癌的治疗现状及趋势分析[J].医学信息,2022.35(18)165-168

基金资助:山东省自然科学基金青年项目(ZR2022QH227); 山东省医药卫生科技发展计划(202109030772);

文章来源:朱杉,胡旭东,赵伟等.RICTOR在食管鳞状细胞癌增殖中的功能研究[J].中华肿瘤防治杂志,2023,30(21):1265-1271.