肺癌的诊疗方式多样，但其发病率及死亡率仍逐年上升，整体疗效并没有大幅度提高[1,2]。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)理论从新的视角为肺癌发生和发展机制提供了合理解释，认为CSCs具有无限增殖、促进血管生成、放化疗抵抗、免疫逃逸等生物特性[3,4,5]。自噬是一种高度保守的蛋白降解途径，是细胞应对恶劣环境因素的重要生存机制之一[6]。研究发现，自噬与CSCs之间存在密切关系，但具体调控机制仍需探索[7,8,9,10]。长链非编码RNA(long non-coding RNAs, LncRNAs)是一种长度>200 nt且不能编码蛋白质的非编码RNA,可调节基因在转录和转录后阶段的表达并在各种细胞过程(如增殖、迁移、凋亡等)中发挥关键作用[11,12,13]。肺癌相关转录本1(lung cancer associated transcript 1,LUCAT1)与肿瘤发生发展存在密切联系，在多种癌组织中异常表达[14,15,16]。本研究旨在分析LUCAT1与自噬的关系，进一步阐明LUCAT1对A549干细胞(A549 stem cells, A549/SC)增殖与迁移的影响，寻求高效的靶向肿瘤干细胞特异性靶点，为肺腺癌治疗新方法提供理论和实验参考。

1、材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

人肺腺癌A549细胞由北纳细胞库购入。RPMI 1640培养基和DME/F12培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，重组人表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和重组人碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)均购自美国 PeproTech 公司，0.25%的胰酶 (含EDTA 0.05%)和FBS购自以色列 Biological Industries 公司，细胞培养瓶、离心管和Transwell板均购自美国Corning公司，兔抗人CD44、Nanog、Bmi-1、p62和Beclin 1均购自美国Proteintech公司，LC3B多克隆抗体购自英国Abcam公司，羊抗兔二抗购自杭州华安生物技术有限公司，逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)试剂盒购自日本Takara, ECL化学发光底物购于上海七海复泰生物公司，qRT-PCR所需引物均由上海生工生物工程有限公司设计合成，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司，BSA封闭液和PVDF膜均购自北京索莱宝公司。倒置相差显微镜、实时荧光定量PCR及荧光显微镜由遵义市第一人民医院中心实验室提供。

1.2 细胞培养及转染

1.2.1 细胞培养

在37 ℃、5% CO2、95%相对湿度条件下，A549亲本细胞(A549/MN)在含有10%的胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI 1640培养基中培养，A549干细胞(A549/SC)在含有20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF和B27的无血清悬浮培养基中培养。选取生长状态良好的A549/MN和A549/SC分别用胰酶和Accutase消化，1 000 r/min、离心5 min(r=8.9 cm),重悬为单细胞悬液后，接种至T 25培养瓶中放入培养箱中培养。观察培养液颜色适时换液。

1.2.2 细胞转染

取对数生长期的A549/SC,参照LipofectamineTM 3000说明书转染LncRNA LUCAT1,构建稳定敲低LUCAT1的A549/SC细胞株(sh LUCAT1组)及对照株(NC-sh LUCAT1组),转染结束后24 h更换细胞培养液。

1.3 CCK 8实验

取对数生长期且3代及以上的细胞进行消化，按照5×103/100 L每个孔接种到96孔板并放于孵箱中，分别在接种后的1、2、3、4 d取出相应的96孔板，吸除孔中原有细胞培养液，每孔加入10 L CCK 8试剂，孵育1.5 h, 在酶标仪450 nm处细胞光密度值D(450 nm),每组细胞至少设置3个复孔。

1.4 克隆形成实验

收集处在对数生长期且状态良好的细胞，消化制成单细胞悬液，按照500个/孔接种细胞至 6孔板中，放置于37 ℃、5% CO2孵箱培养； 续培养10～14 d后肉眼可见明显细胞团，即用冰PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min ,PBS清洗后加入吉姆萨染液染色30 min, PBS清洗去除多余染液，待水分吹干拍照并计数。

1.5 Transwell迁移实验

将细胞消化重悬为单细胞悬液，将100 μL的5×104 mL-1细胞悬液接种至小室中，将小室移至含20% 胎牛血清的细胞培养基500 μL Transwell孔板中，37 ℃、5% CO2的孵箱培养；48 h后吸净上室液体，用冰PBS清洗小室后加入1 mL多聚甲醛固定液室温固定30 min后清洗，每个小室中加入500～1 000 μL预先配置好的0.1%结晶紫染液避光染色30 min, 棉签轻柔擦去上室表面上尚未固定的细胞；镊子揭下膜晾干后固定于载玻片上观察。

1.6 qRT-PCR检测

Trizol法提取细胞总RNA,紫外光吸收法测RNA浓度及纯度，按照逆转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒说明书操作。以β-actin为内参，qRT-PCR试剂盒检测LncRNA LUCAT1表达情况。LUCAT1上游引物：5′-GTTGCGTTACACCCTTTCTT-3′,下游引物：5′-ACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3′。程序结束后用 2-ΔΔCT公式法分析。

1.7 蛋白质印迹法检测

取对数生长的各组细胞株，冰PBS润洗3遍后加入配置好的细胞裂解液裂解细胞，收集蛋白液后，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，制备蛋白样品，上样，进行SDS-PAGE电泳，转模后封闭50 min, 随后孵育不同抗体，4 ℃过夜反应，TBST洗膜3次后加入二抗室温孵育1 h, TBST洗膜3次后，加入显影液曝光，用Image J软件分析电泳条带。

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0.2分析及绘图。本实验数据均为计量资料，采用Shapiro-Wilk方法进行正态分布检验，数据均符合正态分布，数据使用表示，采用独立样本t检验对2组数据进行比较，单因素方差分析(One wayANOVA)对组间差异进行检验。每组实验得到3次有意义结果。检验水准α=0.05(双尾)。

2、结果

2.1 肺腺癌A549干细胞培养及鉴定

A549/MN用含FBS的RPMI 1640培养，可见细胞成多角形贴壁生长；在无血清培养液中竖直培养A549/MN,培养5～7 d后，单细胞悬液逐渐聚集成团；7～10 d后细胞团的体积变大、数量增多；约2周后细胞团体积增大明显，可见细胞团内细胞结合紧密，生长速度明显加快(图1)。蛋白质印迹法实验结果显示，与A549/MN相比，A549/SC高表达干性相关蛋白CD44、Nanog和Bmi-1,A549/SC中上述蛋白表达分别较A549/MN增高约0.37、0.36和0.24倍， CD44表达分别为0.70±0.11和0.96±0.04(t=3.715,P=0.021),Nanog表达分别为0.72±0.03和0.98±0.06(t=6.170,P=0.004),Bmi-1表达分别为0.80±0.06和0.99±0.07(t=3.619,P=0.022),差异均具有统计学意义(图2)。

图1 无血清悬浮培养法诱导肺腺癌A549干细胞(×10)

图2 蛋白印迹法检测干性相关蛋白表达情况   

2.2 A549/SC和A549/MN自噬水平比较

透射电子显微镜下显示，与A549/MN相比，A549/SC中自噬小体数量增多约1.75倍，分别为(4.00±0.82)和(11.00±3.16)个/视野，t=4.260,P=0.004(图3)。蛋白质印迹法结果显示，A549/SC中Beclin1和LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表达分别较A549/MN增高约1.66和0.39倍，p62的蛋白表达较A549/MN下降约0.27倍， Beclin 1表达分别为0.41±0.20和1.09±0.07(t=5.431,P=0.006),LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ表达分别为0.71±0.02和1.00±0.07(t=11.030,P<0.001),p62表达分别为0.99±0.08和0.72±0.15(t=2.831,P=0.047),差异均有统计学意义(图4)。

2.3 LncRNA LUCAT1的表达

qRT-PCR结果显示，A549/SC和A549/MN中LncRNA LUCAT1表达量分别为56.04±6.52和1.04±0.38,t=14.600,P<0.001。与A549/MN相比，A549/SC中存在高表达LncRNA LUCAT1。

2.4 LncRNA LUCAT1慢病毒转染构建稳定细胞株

慢病毒转染细胞72 h后荧光显微镜下观察细胞转染效果(图5)。通过qRT-PCR检测验证转染率显示，NC-sh LUCAT1组和sh LUCAT1组中LncRNA LUCAT1的mRNA表达量分别为0.68±0.23和0.004±0.006, NC-sh LUCAT1组是sh LUCAT1组的159倍，t=5.431,P=0.012。

图3 透射电子显微镜下观察A549/MN和A549/SC中自噬体  

图4 蛋白印迹法检测自噬相关蛋白表达情况   

2.5 沉默LUCAT1对A549/SC克隆形成的影响

NC-sh LUCAT1组和sh LUCAT1组克隆形成数分别为(118.32±3.84)和(56.33±2.73)个/孔，NC-sh LUCAT1组是sh LUCAT1组的2.10倍，t=6.601,P=0.003。见图6。

2.6 沉默LUCAT1对A549/SC增殖的影响

NC-sh LUCAT1组的细胞增长速度是sh LUCAT1组的1.93倍，差异具有统计学意义，t=7.382,P=0.001。见图7。

2.7 沉默LUCAT1对A549/SC迁移能力的影响

NC-sh LUCAT1组和sh LUCAT1组迁移细胞数分别为(816±105.10)和(558.00±120.90)个/视野，NC-sh LUCAT1组是sh LUCAT1组的1.46倍，t=2.797,P=0.004。见图8。

图5 慢病毒转染LncRNA LUCAT1(×10)   

2.8 敲低LUCAT1对干性及自噬相关蛋白表达的影响

慢病毒转染LUCAT1后，与NC-sh LUCAT1组相比，sh LUCAT1组细胞的干性相关蛋白CD44、Nanog和Bmi-1表达分别降低约0.28、0.24和0.21倍，其中CD44表达分别为0.96±0.03和0.69±0.15(t=3.006,P=0.040),Nanog分别为1.02±0.03和0.78±0.06(t=6.666,P=0.003),Bmi-1分别为1.01±0.04和0.80±0.03(t=7.294,P=0.002),差异均有统计学意义。见图9A。

慢病毒转染LUCAT1后，自噬相关蛋白Beclin 1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达分别降低约0.62和0.29倍，p62蛋白表达升高约0.32倍，其中Beclin l表达分别为1.08±0.08和0.41±0.20(t=5.460,P=0.005),LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ分别为0.96±0.43和0.68±0.02(t=4.748,P=0.009),p62分别为0.74±0.12和0.98±0.06(t=2.929,P=0.043),差异均有统计学意义。见图9B。

图6 沉默LUCAT1对A549/SC 克隆能力的影响  

图7 沉默LUCAT1对A549/SC增殖的影响   

3、讨论

CSCs是肿瘤细胞中存在的一小部分高致瘤细胞亚群，具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，在肿瘤生长、远处转移、靶向耐药及放疗抵抗中发挥重要作用[17,18]。相比其他肿瘤干细胞培养方法，如3D细胞培养技术[19]和免疫磁珠分离法[20],无血清悬浮培养法[21]是目前最常用且对细胞伤害较小的一种细胞培养方法，其主要是在培养液中加入外源性有丝分裂原使细胞悬浮生长从而富集成球。本研究在此成熟的干细胞培养方法下，通过无血清悬浮培养法富集获得肺腺癌A549干细胞球，并检测干性相关蛋白CD44、Nanog和Bmi-1表达情况，结果显示A549/SC中以上3种干性相关蛋白的表达均较A549/MN增高，表明富集得到的A549/SC具有更强的自我更新、增殖及多项分化能力。与多项研究结果一致[22,23,24]。自噬是一种高度保守的降解途径，通过该途径受损的细胞器或错误折叠的蛋白质被吞噬成双膜结构，进而被降解为小分子物质(如核苷酸、氨基酸和脂肪酸),以供应细胞适应饥饿、缺氧和DNA损伤等应激条件[25]。有研究表明，自噬与CSCs之间存在密切联系，是CSCs适应恶劣肿瘤微环境的重要生存条件之一[26]。目前自噬相关蛋白主要包括Beclin 1、p62及LC3B,Beclin 1是自噬调节的核心参与者[27];p62参与各种关键的细胞内过程，例如氧化应激和细胞代谢的调节，可被自噬选择性降解[28];LC3B具有显性亚基B,是自噬体膜的组成部分，其较高的表达反映了自噬体数量的增加[29]。因此本研究通过蛋白质印迹法实验分别检测A549/MN、A549/SC中的以上自噬相关蛋白表达情况，结果证实与A549/MN相比，A549/SC中Beclin 1和LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ的表达增高，p62表达降低，且透射电镜观察到A549/SC中自噬体数目较A549/MN增多，进一步表明A549干样细胞具有更高水平的自噬。

越来越多的研究表明，LncRNAs具有调控肿瘤干细胞群(包括乳腺癌、结直肠癌和肝癌等)生物特性的功能[30,31,32]。因此进一步研究LncRNA在肿瘤发生、发展中的作用，为深入研究肺癌提供了新的视角。LUCAT1是一种长度约为890nt的非编码RNA,其原始功能是调节基因表达并介导氧化应激保护。多项研究报道LUCAT1可通过多种途径调控肿瘤的发生发展，如Lin等[33]发现，LUCAT1通过抑制结直肠癌细胞的DNA损伤和细胞凋亡增强肿瘤细胞的活力和致瘤性；Lou等[34]发现，LUCAT1表达上调显著促进了异体种植模型中肝癌细胞的增殖和侵袭。本研究发现，LncRNA LUCAT1在A549/SC中明显高表达；敲低LUCAT1后，与对照组相比，A549/SC的增殖和迁移能力均被抑制，且干性相关蛋白的表达也明显降低。上述结果提示LUCAT1促进A549/SC增殖和迁移，正向调控干性相关蛋白的表达，两者之间的具体调控机制值得进一步探索。

图8 沉默LUCAT1对A549/SC迁移能力的影响(结晶紫染色，×10)  

图9 沉默LUCAT1对A549/SC自噬和干性相关蛋白表达的影响   

有研究指出，LncRNAs与自噬之间存在一定的联系，如Luo等[35]发现，LncRNA EIF3J-DT可激活自噬使胃癌细胞的耐药性增强；Yang等[36]发现，LncRNA ADAMTS9-AS1表达上调可影响自噬从而影响膀胱癌细胞的细胞周期，抑制其凋亡。本研究结果显示，抑制LUCAT1表达后，A549/SC中Beclin 1和LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ表达较对照组下降，p62表达增强，表明LUCAT1可促进自噬相关蛋白表达进而激活自噬。

综上所述，无血清悬浮培养法可富集得到肺腺癌A549干样细胞，且具有高水平自噬，在A549/SC中存在高表达LncRNA LUCAT1,其可激活自噬在维持A549/SC的干性中发挥重要作用。这将为寻求靶向肿瘤干细胞的特异性靶点提供新的思路。

参考文献:

[10]郑厚麟,李亚军.自噬与肿瘤干细胞放疗抵抗的研究进展[J].肿瘤预防与治疗,2021,34(11):1080-1083.

[13]王钰琼,吴耀钦,郑鹏.lncRNA HOTAIR靶向调控血管舒张剂激活磷蛋白对宫颈癌细胞迁移与侵袭的影响[J].中华肿瘤防治杂志,2023,30(12):708-717.

基金资助:国家自然科学基金(82060544);贵州省自然科学基金[黔科合基础-ZK(2023)一般486];遵义市第一人民医院研究与试验发展(R&D)计划[院科字(2020)10号];

文章来源:王鑫,姜梅,李乐瑶等.LncRNA LUCAT1激活自噬对肺腺癌A549干细胞影响的研究[J].中华肿瘤防治杂志,2024,31(01):11-18.