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循环肿瘤细胞和循环肿瘤脱氧核糖核酸检测的应用研究

2020-10-22 260 上传者：管理员

摘要：目的探讨循环肿瘤细胞和循环肿瘤脱氧核糖核酸检测在预测晚期非小细胞肺癌免疫治疗效果中的应用价值。方法选取2016年2月至2017年2月上海市胸科医院收治的接受免疫治疗的79例晚期NSCLC患者为研究对象,采集患者治疗前后空腹静脉血,采用免疫磁珠法和免疫荧光染色法检测CTC数目,采用杂交捕获高通量测序检测外周血ctDNA的单核苷酸变异,分析CTC数目、ctDNA基因突变与免疫治疗效果和无进展生存时间的关系。结果79例晚期NSCLC患者中有54例检测到CTC,阳性率为68.35%,每4ml外周血含有的中位CTC数目为4个(0～53个)。Ⅳ期NSCLC患者CTC阳性率显著高于Ⅲ期NSCLC患者(P<0.05),免疫治疗后CTC阳性率显著低于免疫治疗前(P<0.05)。按照实体肿瘤疗效评价标准1.1,部分缓解23例,疾病稳定46例,疾病进展10例;部分缓解患者中,CTC数目升高2例,不变9例,降低12例;ctDNA基因变异数<2为24例,变异数≥2为55例。Spearman相关性分析显示CTC数目变化和ctDNA基因变异数与免疫治疗效果均呈显著负相关(均P<0.05)。基线期CTC阴性组与阳性组患者、ctDNA基因变异数<2组与≥2组患者PFS时间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论CTC和ctDNA基因突变与晚期NSCLC患者肿瘤转移相关,外周血CTC和ctDNA检测对接受免疫治疗的晚期NSCLC患者的治疗效果和预后可能具有一定的预测价值。

关键词：
免疫治疗
循环肿瘤细胞
循环肿瘤脱氧核糖核酸
肿瘤诊断
非小细胞肺癌
预测价值
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肺癌是世界范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤,每年有近180万新增病例,140万例患者死于肺癌,肺癌已成为我国居民恶性肿瘤死亡的首位原因,其占比远远超过20%[1]。按照病理分型,肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中NSCLC占比为85%,由于患者早期症状不典型,确诊时多已处于晚期,失去了外科手术治疗机会,导致患者5年总体生存率低于15%[2]。研究证实,循环肿瘤细胞与肿瘤转移密切相关[3]。循环肿瘤脱氧核糖核酸是循环系统中携带原始肿瘤突变的DNA片段,具有可重复、侵袭性小、实时监测等特点,其可从分子水平揭示肿瘤的遗传特征[4]。近年已有采用ctDNA评估结直肠癌和乳腺癌治疗效果和预后的报道[5,6],但将其用于预测肺癌免疫治疗效果的报道并不多。本研究旨在探讨CTC和ctDNA检测在预测晚期NSCLC免疫治疗效果中的应用价值,具体报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2016年2月至2017年2月于上海市胸科医院接受免疫治疗的79例晚期NSCLC患者为研究对象。纳入标准:①年龄18～76岁;②符合NSCLC诊断标准[7];③经病理学检查确诊;④根据肺癌TNM分期[8]分为ⅢA、ⅢB、Ⅳ期;⑤美国东部肿瘤协作组评分0～2分;⑥血常规和心、肺、肝、肾功能均正常,可耐受免疫治疗;⑦预计生存期超过3个月;⑧未接受过任何局部或全身抗肿瘤治疗。排除标准:①已接受手术、放疗或化疗;②治疗依从性差;③缺乏NSCLC病理学诊断结果;④同时性肺癌和异时性肺癌患者;⑤既往有肿瘤病史;⑥无可测量的病灶;⑦合并感染性/传染性疾病;⑧合并严重基础疾病,如心脏病、高血压、糖尿病等;⑨缺乏随访资料。入选患者中,男53例,女26例;年龄18～76(61.43±7.15)岁;有吸烟史57例,无吸烟史22例;病理类型:腺癌49例,鳞状细胞癌18例,大细胞癌12例;分化程度:高分化9例,中分化28例;低分化42例;TNM分期:ⅢA期10例,ⅢB期15例,Ⅳ期54例。本研究经上海市胸科医院医学伦理委员会审核批准(批件号:2017-第102号)。

1.2方法

1.2.1免疫治疗方法

所有患者均接受免疫治疗,纳武利尤单抗治疗剂量为3mg/kg,每2周治疗1次为1个疗程,治疗2个疗程后评价疗效。

1.2.2外周血CTC检测

采集患者免疫治疗前后空腹静脉血4ml置于抗凝管中作为检测样本。采用免疫磁珠法和免疫荧光染色法于48h内完成CTC数目检测。将4ml静脉血注入装有6.5ml磷酸盐缓冲液的试管中,混匀,将离心后的样本置入Autoprep系统中富集标记CTC,吸取上清液,加入PBS和磁颗粒进行磁孵育,初步处理后,将液体和未结合的磁颗粒吸出,移除磁场,将富集后的细胞重悬于PBS中,加入染色剂[4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染料、异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)染料]进行染色标记,经MagNest磁场避光孵育20min,将样本转移至样本盒分析表面,形成单细胞层。采用CellTracks自动分析仪进行扫描分析。CTC阳性判定:①白细胞表面抗原CD45阴性;②DAPI核染色阳性呈紫蓝色;③CK8/19/20表达阳性呈绿色;④细胞形态完整,体积较大(>4μm3×4μm3×4μm3)。按上述标准进行细胞图像分析和计数,结果由2名技师审核。

1.2.3外周血ctDNA检测

①血浆DNA提取:采集患者免疫治疗前后空腹静脉血5ml,室温下3000r/min离心10min,分离血细胞和血浆,收集血浆样本,采用QiagenDNA提取试剂盒,保留游离DNA溶液,测定浓度后置于-80℃冰箱备用。②ctDNA分离:采用薄膜柱吸附试剂盒由血浆中分离ctDNA,通过ctDNA大片段分离、小片段回收、DNA末端修复等步骤构建DNA文库,采用聚合酶链反应扩增文库用于后续目的片段的捕获和测序试验。③高通量测序:采用llluminaHiSeq平台第二代高通量测序技术检测免疫治疗后外周血中的ctDNA,下机数据通过生物信息平台整理为样本突变信息。

1.3随访

免疫治疗后随访1年,每隔3个月复查1次,电话随访1个月1次,不能入院复查者以电话随访结果为准,无进展生存时间为开始免疫治疗至疾病进展的时间,末次随访时间为2018年2月。

1.4观察指标

①免疫治疗效果评价:按照实体肿瘤疗效评价标准1.1[9]分为部分缓解、疾病稳定(stabledisease,SD)、PD。②患者免疫治疗前后CTC阳性率,并分析CTC数目变化与免疫治疗效果的关系。③ctDNA基因突变以变异数2为分界,分为变异数<2组和变异数≥2组,分析ctDNA基因突变与免疫治疗效果的关系。

1.5统计学方法

所有数据输入SPSS20.0软件进行统计学分析。连续型资料以均数±标准差(x¯±s)表示,比较采用独立样本t检验;分类资料以例(%)表示,比较采用χ2检验。采用Spearman相关系数进行CTC数目变化、ctDNA基因突变数与免疫治疗效果的相关性分析,采用Kaplan-Meier法进行生存分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1CTC检测结果

79例晚期NSCLC患者中有54例检测到CTC,阳性率为68.35%,每4ml外周血含有的中位CTC数目为4个(0～53个)(图1)。

图1CTC免疫荧光染色图（DAPI核染色）

注：CTC为循环肿瘤细胞；DAPI为4',6-二脒基-2-苯基吲哚；A为DAPI蓝色检测细胞核染为蓝色；B为CD45抗体染为绿色标记白细胞（20×）

2.2不同分期NSCLC患者治疗前CTC阳性率比较

Ⅲ(ⅢA+ⅢB)期NSCLC患者25例,CTC阳性率为44.00%(11/25);Ⅳ期NSCLC患者54例,CTC阳性率为79.63%(43/54);Ⅳ期NSCLC患者CTC阳性率显著高于Ⅲ期NSCLC患者(χ2=10.029,P=0.002)。

2.3NSCLC患者免疫治疗前后CTC阳性率比较

免疫治疗前CTC阳性率为68.35%(54/79),免疫治疗后CTC阳性率为51.90%(41/79),免疫治疗后CTC阳性率显著低于免疫治疗前(χ2=4.462,P=0.035)。

2.4CTC数目变化与免疫治疗效果的关系

RECIST1.1评价结果显示:免疫治疗后,PR23例,SD46例,PD10例;PR患者中,CTC数目升高2例,不变9例,降低12例;Spearman相关性分析显示CTC数目变化与免疫治疗效果呈显著负相关(r=-0.537,P=0.018)(表1)。

表1CTC数目变化与免疫治疗效果的关系[例(%)]

注:CTC为循环肿瘤细胞;RECIST为实体肿瘤疗效评价标准;PR为部分缓解;SD为疾病稳定;PD为疾病进展

2.5ctDNA基因突变与免疫治疗效果的关系

79例晚期NSCLC患者中,变异数<2组患者为24例,变异数≥2组患者为55例。Spearman相关性分析显示ctDNA基因变异数与免疫治疗效果呈显著负相关(r=-0.589,P=0.012)(表2)。

表2ctDNA基因突变与免疫治疗效果的关系[例(%)]

注:ctDNA为循环肿瘤脱氧核糖核酸;RECIST为实体肿瘤疗效评价标准;PR为部分患者;SD为疾病稳定;PD为疾病进展

2.6基线期不同CTC状态和ctDNA基因突变晚期NSCLC患者PFS生存曲线

基线期CTC阴性组患者中位PFS时间为31.46周,CTC阳性组患者中位PFS时间为17.74周,两组比较差异有统计学意义(χ2=5.644,P<0.05)。ctDNA基因变异数<2组患者中位PFS时间为33.80周,变异数≥2组患者中位PFS时间为16.45周,两组比较差异有统计学意义(χ2=3.880,P<0.05)(图2、图3)。

3、讨论

NSCLC是一种恶性程度较高且易复发/转移的恶性肿瘤,50%以上患者确诊时已为晚期,即使接受根治性手术治疗,效果也不甚理想。免疫治疗、靶向治疗成为治疗NSCLC的新方法[10]。程序性死亡蛋白-1(programmeddeath-1,PD-1)和程序性死亡蛋白配体-1(programmeddeathligand-1,PD-L1)是当下肿瘤免疫治疗最热门的靶点,PD-1抑制剂(如纳武利尤单抗)的作用原理是通过解除癌细胞对自身免疫系统的抑制,使自身免疫系统杀伤癌细胞,该药已用于黑色素瘤、NSCLC、肾细胞癌、膀胱癌等的治疗[11]。虽然NSCLC的免疫治疗已迈入2.0时代,但免疫治疗后肿瘤的生物学特性可能已发生一系列变化。在治疗前获取肿瘤信息才能较准确地反映肿瘤的生物学特征,如待疾病恶化后再获取组织标本则相当困难[12]。因此,如何选择生物标志物来预测免疫治疗效果仍是医学领域关注的重点,仅通过组织标本检测给临床研究带来了诸多不便,因此需开拓无创方法来获取患者的肿瘤信息。

图2基线期不同CTC状态晚期NSCLC患者的生存曲线

注：CTC为循环肿瘤细胞；NSCLC为非小细胞肺癌；PFS为无进展生存

图3不同ctDNA基因突变晚期NSCLC患者的生存曲线

注：ctDNA为循环肿瘤脱氧核糖核酸；NSCLC为非小细胞肺癌；PFS为无进展生存

血液CTC和ctDNA的释放被认为与肿瘤转移密切相关,是肿瘤细胞自行分泌、凋亡或坏死的重要特征。由于血液检测具有方便、快捷、无创的优点,故被称为“液体活检”[13]。肿瘤转移是一个多种因素共同参与的过程,恶性肿瘤原发灶和转移灶的肿瘤细胞易进入血液循环或淋巴循环成为CTC,获得转移能力,这些细胞通过迁移、黏附聚集成团形成微小癌栓,具有更强的生存能力,可在不同的组织和器官中定植,进而发展为转移灶[14]。外周血中的CTC在机体免疫系统的作用下被大量吞噬和灭活,CTC数目非常少,若在外周血中检测到CTC,即预示着患者预后不良[15]。有学者认为血液中的肿瘤细胞是肿瘤复发/转移的重要因素,因此,动态监测外周血CTC数目有助于预测NSCLC患者免疫治疗效果和预后[16]。肿瘤治疗主要根据临床分期来进行,但部分早期患者可能已存在微转移,若单纯依靠临床分期制订治疗方案可能会使治疗强度不足,而外周血CTC和ctDNA检测则可以弥补此种不足。本研究79例晚期NSCLC患者中有54例检测到CTC,阳性率为68.35%,每4ml外周血中含有的中位CTC数目为4个(0～53个),Ⅳ期NSCLC患者CTC阳性率显著高于Ⅲ期NSCLC患者,经过2个疗程的免疫治疗后,CTC阳性率显著降低至51.90%;上述结果均提示外周血CTC的产生可能与肿瘤负荷有关。进一步分析发现,CTC数目变化与免疫治疗效果呈显著负相关,基线期CTC阴性组患者PFS时间显著长于CTC阳性组,这也充分肯定了CTC对晚期NSCLC患者免疫治疗效果和预后的预测价值。

早在1948年,已有学者在人类血浆中检测到游离DNA,为游离DNA的研究拉开了序幕[17]。ctDNA是指能够反映肿瘤基因组信息的游离DNA,主要来源于凋亡和坏死的肿瘤细胞或肿瘤细胞的外排体[18]。组织学测序一直被认为是临床和科研测序的金标准,但其在组织获取和样本保存等方面存在困难,而血液ctDNA检测同样能反映组织相同的基因组信息,也弥补了组织活检的不足,已成为补充或替代组织学测序的最佳方法[19]。血液ctDNA检测不仅具有无创的优势,还能准确反映短期内的肿瘤负荷,实时动态监测药物治疗效果,能较早地预测病情变化[20]。但ctDNA测序技术在临床应用中也面临着诸多问题,其操作步骤较烦琐,样本收集、储存、DNA提取、测序等操作均可能影响结果的准确性[21]。本研究采用高通量测序技术,79例晚期NSCLC患者ctDNA基因变异数<2为24例,变异数≥2为55例,且ctDNA基因变异数与免疫治疗效果呈显著负相关,这说明在免疫治疗过程中,ctDNA发生了基因突变,外周血ctDNA可反映晚期NSCLC患者免疫治疗过程中的信息,也证实了外周血检测晚期NSCLC患者的ctDNA基因突变是切实可行的。

综上所述,CTC和ctDNA基因突变与晚期NSCLC患者肿瘤转移相关,外周血CTC和ctDNA检测对接受免疫治疗的晚期NSCLC患者的治疗效果和预后可能具有一定的预测价值。

参考文献：

[10]丁海斌.非小细胞肺癌患者调节性T细胞浸润情况及临床意义[J].中国医学前沿杂志(电子版),2018,10(5):86-89.

张静,纪灏,李志夫.循环肿瘤细胞和循环肿瘤脱氧核糖核酸检测在预测晚期非小细胞肺癌免疫治疗效果中的应用研究[J].中国医学前沿杂志(电子版),2020,12(10):109-113.