Zgy-2是根据中医基础理论，选用外科最常用的、有“外科圣药”之称的红升丹作为主要成分，加入樟脑、薄荷脑，创制的新的配方[1-2]。方中红升丹、樟脑、薄荷脑协同发挥抗炎、抗感染、改善局部血供、促进血管等组织再生等作用。在本研究中，采用脐静脉血管内皮细胞为模型，脐静脉血管内皮细胞已被广泛用于研究血管内皮细胞的功能及血管增生的模型[3-5]。在高糖环境中，观察加入不同浓度的Zgy-2后对脐静脉血管内皮细胞功能的影响，现报道如下。

1、材料与方法

1.1 材料

见表1。

表1材料与厂家

1.2 实验仪器

见表2。

表2主要实验仪器与厂家

1.3 药物及试剂配制

中药合剂Zgy-2的配制：称取薄荷脑13.5 g, 樟脑9.0 g, 在80 ℃水浴下融化，加入红升丹0.5 g, 医用甘油77 g充分搅拌，使总量为100 g。混匀后转移至棕色瓶中备用，常温保存。

1.4 实验方法

1.4.1 脐静脉血管内皮细胞培养：

将>20 cm健康产妇的新生儿脐带用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗干净，剪去夹痕及血肿部分。用止血钳夹住一端，在另一端注入37 ℃的PBS,放置10 min, 如此重复3次，洗去脐带内残留血液。把三通管的一端插入脐静脉，闭合一孔，从另一孔加入0.25%胰蛋白酶，充满脐带，使其消化，在无菌情况下37 ℃孵育15 min, 用胎牛血清终止消化。用PBS冲洗3次，离心后弃去上清液，加入M199培养液，使细胞密度为1×105/ml。设置二氧化碳孵育箱温度为37 ℃进行细胞培养[6]。

1.4.2 脐静脉血管内皮细胞鉴定：

(1)取出细胞后在倒置显微镜下观察细胞的形态特征。(2)血管性血友病因子(VWF)相关抗原免疫荧光检查：取盖玻片0.5 cm×0.6 cm, 灭菌后放入24孔塑料培养板孔中。滴入细胞悬液，调整每孔中细胞密度为1×105/ml。加入M199培养基进行培养。细胞生长到接近融合状态时取出24孔塑料培养板孔。弃掉旧培养基，用PBS 2～3 ml缓慢摇晃，弃掉PBS,重复2～3次。用冷丙酮固定7 min。PBS冲洗3次，每次1 min。行间接免疫荧光检查，弃去24孔板中残留的PBS,取50 μl的Blocking buffer均匀点在玻片中间进行封闭。在常温下作用30 min。将第一抗体即鼠抗人VWF单克隆抗体1∶20倍进行稀释。弃去Blocking buffer封闭液，加入一抗50 μl于盖玻片上，放置于4 ℃冰箱过夜。吸去一抗，用PBS冲洗3次，每次5 min。二抗为异硫氰酸标记羊抗鼠IgG。将二抗稀释配好吸打均匀，每孔中滴50 μl。在室温条件下1 h, 吸掉二抗。用PBS冲洗3次，弃掉PBS,加入吸打均匀的DAPI核染料50 μl染5 min。弃掉DAPI,用PBS洗过后用14 μl封片剂滴到载玻片上。用PBS冲洗后将玻片倒扣在盖玻片上，擦掉PBS,封片。荧光显微镜下观察摄片[7]。

1.4.3 细胞传代：

配制含10%二甲基亚砜(DMSO)、10%胎牛血清的冻存培养液，现配现用。用倒置显微镜观察细胞生长的融合度达到80%～90%时进行传代。吸出旧培养液，用PBS清洗。加入胰酶使细胞消化。离心后弃去上清液，加入新鲜的M199培养基。反复吹打离心后，弃去上清液。加入M199培养基4 ml, 形成细胞均匀悬液。每隔2 d更换新鲜培养基[8]。

1.4.4 细胞冻存：

脐静脉血管内皮细胞生长于对数生长期时，弃去旧培养液，加入PBS,轻轻摇晃清洗细胞后去除PBS。轻拍培养瓶帮助脐静脉血管内皮细胞分离，加入胰蛋白酶0.5 ml使细胞消化下来。将混悬液以1 000 r/min的速度离心5 min。去除上清液，加入冻存培养液，反复轻轻吹打细胞，调整细胞混悬液密度为5×106/ml后将其装入不同的冻存管中，体积大约为每管1 ml。按照标准的冻存程序冻存脐静脉血管内皮细胞[9]。

1.4.5 细胞复苏：

取出冻存管后置于37 ℃的恒温水浴箱中。溶解充分后，将其移入到离心管中，加10倍以上的M199细胞培养液。混合吹打均匀后以1 000 r/min的速度离心5 min。弃去上清液，加入M199细胞培养液重悬细胞。调整细胞密度为5×106/ml。将细胞悬液接种到不同的培养瓶中放入培养箱中静置培养，次日更换M199培养液[6]。

1.4.6 药物浓度的确定：

为了确定最佳实验浓度，把Zgy-2用培养基稀释，以0 μg/ml为对照，分别设50、100、200、400、800、1 600、3 200 μg/ml共7个浓度，利用MTT法检测该药对血管内皮细胞的增殖活性的影响。采用96孔板，在高糖环境下培养，每孔1×105个细胞/100 μl, 连续检测6 d。

1.4.7 实验分组：

实验分为4组，正常对照组、高糖培养组(葡萄糖50 μg/ml)、高糖培养+低剂量药物组(葡萄糖50 μg/ml+Zgy-2 200 μg/ml)、高糖培养+高剂量药物组(葡萄糖50 μg/ml+Zgy-2 400 μg/ml)。

1.5 指标采集与检测

1.5.1 MTT法测定细胞增殖和活力：

首先接种细胞，取出96孔板，细胞计数后按每孔104个细胞种植其上。按照不同分组进行编号区分。在不同组别分别设置加入培养液、MTT、二甲基亚砜的调整孔及在此基础上含有细胞的对照孔。将孔板移入二氧化碳培养箱中培养，24 h后每孔加MTT 10 μl。充分混合均匀后，置于37 ℃的二氧化碳培养箱中孵4 h后，取出后弃掉上清液，每孔加入颗粒溶解液DMSO,剂量100 μl。然后盖上盖子，放在酶标板振荡器上低速震荡10 min。结晶完全溶解后打开盖子，将96孔板放入酶标仪，设置波长570 nm后测吸光度OD值[10]。

1.5.2 细胞计数法测定细胞增殖和活力：

将生长良好的细胞按每孔104个细胞种植于96孔板，每孔按照分组分别加入培养液和含有葡萄糖及Zgy-2药物的培养液0.2 ml。培养24 h后，弃去旧培养液，用0.5%胰酶100 μl消化10 min, 吸入离心管，加培养液至1 ml, 用细胞计数板进行细胞计数。

1.5.3 荧光免疫组化检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达

1.5.3.1 制作细胞爬片：

在超净工作台中放入培养皿，装入75%乙醇，将玻片放入其中浸泡，浸泡时间为24 h。取1个24 孔板，滴入M199培养基，剂量为50 μl。将玻片取出后浸入培养基。

1.5.3.2 接种细胞：

取24孔板，每孔加入100 μl细胞浓度为2×105/ml的细胞悬液。按照实验分组加入葡萄糖及Zgy-2溶液后调整每孔为200 μl。培养24 h后取出培养板，吸去旧培养基，加入新鲜培养基孵育10 h。

1.5.3.3 固定染色：

取出细胞培养瓶，吸去旧培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞5 min, 重复3次。取4%多聚甲醛进行细胞固定20 min。用PBS将细胞反复冲洗3 次，每次时间为5 min; 用0.1% Triton X-100对细胞进行通透处理5 min。用PBS冲洗3 次，每次时间为 5 min; 用牛血清白蛋白溶液对细胞进行封闭，在室温条件下20 min。PBS反复冲洗3次，每次5 min; 对细胞进行染色，采用FITC-液，浓度为5 μg/ml, 每孔剂量为200 μl。放置于37 ℃培养箱，持续染色时间为40 min。将培养基取出后弃去FITC-液染色液，用PBS重复浸洗，持续3次，每次5 min。整个过程需要避光操作；对细胞进行封片处理，取DAPI加入抗荧光封片剂，共10 μl, 在暗湿盒条件下进行保存[11]。

1.5.3.4 激光共聚焦显微镜观察：

各选取5个视野，200倍镜下观察后使用Image J软件进行荧光定量。本实验重复3次，取均数运用统计学软件进行统计学分析。

1.5.4 流式细胞仪检测细胞凋亡：

用PBS冲洗3次后用0.1%胰酶消化细胞3 min, 加入少量胎牛血清，用移液枪吹打细胞至细胞分散。收集到10 ml离心管中，以1 500 r/min的速度高速离心5 min, 弃去上清。用冷PBS清洗细胞2次后离心5 min。调整细胞密度至105/ml。每管样本内加入5 μl的Annexin V和5 μl的PI,轻轻摇匀常温下放置15 min后上机检测[12]。

1.6 统计学方法

应用SPSS 26.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差

表示。2组独立样本均数均行统计描述、方差齐性检验方法。方差齐用单因素方差分析(ANOVA),方差不齐用秩和检验，在运算过程中所有检验均为双侧检验。P<0.05表示分析的数据结果具有统计学意义。

2、结果

2.1 脐静脉血管内皮细胞的培养

刚分离出来的脐静脉血管内皮细胞悬浮在培养液中，大多呈现圆形。在培养6 d时，细胞长势良好，形态舒展，鹅卵石样，镶嵌排列。细胞扁平，多角和短羧形边界清楚，几乎无重叠。

2.2 脐静脉血管内皮细胞的鉴定

通过免疫荧光染色，结果发现细胞核经过DAPI染色后呈现蓝色，而细胞质由于含有VWF蛋白则呈现绿色。经过计数分析，绿染细胞超过95%。证明所培养的细胞为脐静脉血管内皮细胞。通过普通的免疫组化染色，多数细胞呈现染色，再次证明了所培养的细胞为脐静脉血管内皮细胞。

2.3 Zgy-2最佳浓度的确定

实验结果显示，药物浓度在200 μg/ml和400 μg/ml时，药物的作用效果最好。药物浓度<200 μg/ml时，效果不明显；>800 μg/ml, 细胞大量死亡。基于实验结果选用200 μg/ml和400 μg/ml的Zgy-2作为实验剂量。

2.4 Zgy-2对脐静脉血管内皮细胞增殖的影响

2.4.1 MTT法测定Zgy-2对细胞增殖的影响：

与正常对照组比较，高糖培养组细胞增殖活力OD值明显降低(P<0.05)。高糖培养的脐静脉血管内皮细胞经过Zgy-2处理后，高糖培养+低剂量药物组、高糖培养+高剂量药物组的细胞增殖活力OD值与高糖培养组相比呈现增强趋势，见图1。

图1Zgy-2对脐静脉内皮细胞增殖活力的影响

2.4.2 细胞计数法检测Zgy-2对细胞增殖的影响：

随着时间延长，高糖培养组细胞数目显著减少，说明高糖环境对细胞的生长有损害作用；而高糖培养+低剂量药物组、高糖培养+高剂量药物组细胞数目显著增加，说明Zgy-2可显著抑制高糖对细胞增殖的抑制作用(P<0.05),见图2。

2.4.3 显微镜观察Zgy-2对细胞形态的影响：

细胞经过药物处理后，与高糖培养组比较，高糖培养+低剂量药物组、高糖培养+高剂量药物组细胞密度较大，细胞在低倍镜下显得较小，可能和细胞密度有关，其他未见明显变化。

2.5 VEGF的表达

与正常对照组比较，高糖培养组VEGF表达减少(P<0.05),这说明高血糖可抑制VEGF的表达。而与高糖培养组比较，高糖培养+低剂量药物组和高糖培养+高剂量药物组对细胞VEGF的表达有促进作用(P<0.05),见表3。

图2Zgy-2对脐静脉内皮细胞数目的影响

表3Zgy-2对脐静脉VEGF表达的影响

2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

与正常对照组比较，高糖培养组细胞凋亡率显著升高(P<0.05);而高糖培养+低剂量药物组和高糖培养+高剂量药物组细胞凋亡率均低于高糖培养组(P<0.05),说明高血糖可促进血管内皮细胞凋亡的发生，而通过Zgy-2的治疗，可抑制其凋亡，见表4。

表4Zgy-2对脐静脉血管内皮细胞凋亡的影响

3、讨论

高糖环境下，血管内皮细胞的结构和功能受到严重影响，导致血管内皮增生不良。而肉芽组织的正常增生，需要大量的血管生成，血管的生长需要完好的血管内皮细胞。本研究发现中药合剂Zgy-2可能参与修复高糖环境下受损的血管内皮细胞，改善血管生成障碍。

血管内皮迁移在多种病理生理中发挥重要作用，血管内皮的迁移有助于促进血管内皮的完整性和血管的增生。在高糖培养条件下，血管内皮细胞迁移能力明显下降。使用Zgy-2治疗后，无论高剂量还是低剂量均具有明显的促进内皮细胞迁移的能力，说明该药可通过促进血管内皮迁移能力而达到促进伤口愈合的作用。

在高糖环境下，脐静脉血管内皮细胞凋亡率迅速增加，说明高糖诱导对内皮细胞的损伤十分严重。本研究结果发现Zgy-2可提高细胞活力，明显抑制细胞凋亡，从而维持了血管内皮细胞的数量和功能正常，促进了肉芽组织内毛细血管的正常增生，起到促进伤口愈合的作用。在高糖环境下，血管内皮细胞分泌VEGF的功能严重受损，而Zgy-2可促进细胞对VEGF的分泌。由于本研究工作的局限性，实验中检测细胞凋亡指标相对简单，后期实验将进一步补充相关的分子机制。

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基金资助:河南省高等学校实验室工作研究会项目(ULAHN202367);

文章来源:杜艳平,孙永琨.中药合剂Zgy-2对高糖环境下血管内皮细胞的影响[J].临床合理用药,2024,17(25):27-30+40.