脑卒中具有高致残率和高死亡率［1］，其中绝大多数属于缺血性卒中。脑组织在经历短暂的缺血后恢复血流供应，此过程导致的病理损伤为脑缺血再灌注（CIR）［2］。多重复杂机制在CIR的过程中引起了一系列损伤，氧化应激反应作为机体内氧化与抗氧化平衡被打破并且更偏向于氧化的一种病理状态，被认为是导致脑组织以及神经功能损伤的关键原因之一［3］。根据现有研究，Keap1/Nrf2/ARE信号通路在诸如大脑、肺部、肝脏及心肌等多个器官中都展现出了显著的保护作用，上调该通路可以减轻这些器官的氧化应激损伤［4］。已有研究表明，CIR大鼠脑部氧化应激损伤可以在艾灸干预下被缓解［5］。基于现有研究，艾灸对CIR大鼠大脑氧化应激损伤的防护效应可能与沉默信息调节因子2相关酶1/叉头状转录因子O3（SIRT1/FoxO3）通路［6］和血红素氧合酶1（HO-1）［7］等有关。Nrf2作为HO-1等抗氧化酶的上游蛋白，是细胞抗氧化应激的关键调控因子。目前尚不确定艾灸改善急性CIR损伤的作用机制中是否有Keap1/Nrf2/ARE信号通路的参与。本研究建立急性CIR大鼠模型，观察通督灸对急性CIR大鼠大脑氧化应激损伤的影响，研究其作用机制，以期为缺血性卒中等疾病的临床应用提供实验依据。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级雄性SD大鼠90只，13~15周龄，体质量（250±10）g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2019-0010。大鼠在山西中医药大学实验室动物房内进行饲养。动物房内的温度和湿度分别维持在（22±2）℃、（50±5）%的水平，室内明暗交替时间各半，适应性喂养7d。

1.2试药与仪器优质艾绒

（新乡医邦，批号CB1587）；MCAO线栓（型号M8509，北京西浓）；戊巴比妥（批号820219，上海试制二厂）；2%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液（货号G3005-100）；Keap1抗体（货号RMAB50432，Bio-swamp）；Nrf2抗体（货号A11159，ABclonal）；HO-1抗体（货号RMAB50730，Bio-swamp）；NQO1抗体（货号PAB32354，Bio-swamp）；β-actin抗体（货号MAB48206，Bio-swamp）；ATRA（MedChemExpress）；依达拉奉（货号M70800，Sigma-Aldrich）；超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）检测试剂盒（Bioswamp）。

1.3分组与造模

90只SD大鼠按照随机数字表法分为6个组，分别是假手术组、模型组、模型+ATRA组、依达拉奉组、通督灸组、通督灸+ATRA组，各组15只大鼠。除假手术组外均进行造模。禁食后给予大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠40mg/kg麻醉［8］，构建右侧大脑中动脉栓塞（MCAO）模型［9］。步骤如下：首先除去大鼠颈前部毛发，在正中用手术刀慢慢划开小口，对右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）实施钝性分离操作，分别结扎CCA近心端和ECA远心端，预留结扎线，将ICA的远心端用动脉夹夹闭。于CCA分叉处下方1~2mm处剪开一个小切口，将线栓从切口处插入穿过CCA分叉进入ICA，稍遇阻力时停止，束紧预先放置在CCA的结扎线。用4-0缝合线缝合伤口并敷上青霉素消毒。在缝合部位的皮肤外预先留出线栓尾部1~2cm的长度，并在缺血发生2h后，将线栓重新抽出至颈总动脉的分叉处位置。假手术组仅进行血管的钝性分离，没有进行插线栓和结扎的操作。

1.4干预方法

所有干预从手术造模完成后的第2天开始。依达拉奉组对大鼠进行了尾静脉注射依达拉奉3mg/kg［10］。模型+ATRA组给予大鼠腹腔注射ATRA（10mg/kg，2.5mg/mL）［11］。通督灸组：大鼠固定于俯卧位，沿着背部脊柱区域剪去大约2.5cm宽、5.5cm长的毛发，然后将新鲜的生姜研磨为绿豆般大小，控掉其中1/3的水分，放进自制的容器中，制备出5cm长、2cm宽、3mm高的姜饼，在自制的三角形艾炷模具中填满艾绒，制成以边长为5mm的等边三角形为底，高为4cm的三角形艾炷。对大鼠背部进行消毒后，将姜饼放置于备皮处的中央，并且在姜饼上按照督脉的走行方向放置艾炷，于三角艾炷的顶端尖部上每隔1cm距离滴入1滴酒精，用线香将艾炷点燃开始施灸，当第1壮艾炷完全燃尽后更换下一壮，每次灸3壮，约20min。通督灸操作规范参考文献［12］进行，参考《实验针灸学》［13］进行督脉的定位，包括大椎、脊中等穴。通督灸+ATRA组在每日通督灸治疗前30min，给予ATRA（10mg/kg，2.5mg/mL）腹腔注射。各组干预均为每日1次，持续3d。

1.5神经功能学评分

［14］观察全部大鼠干预后的神经功能损伤状态，0分表示没有任何神经功能受损迹象；1分为大鼠不能完全展开其患侧的前爪；2分为大鼠在行走过程中出现向患病一侧转圈的症状；3分为大鼠在行走过程中，身体出现向患病一侧倾倒的症状；4分为大鼠无法自发走动，甚至失去意识、死亡。在此次实验中，得分为0、4的大鼠被剔除，剩余的纳入研究。若在手术过程中出现大鼠死亡的情况，则需要及时补充。

1.6标本采集与检测

1.6.1脑梗死体积

神经功能学评分结束后，每组随机选出5只大鼠，麻醉后断头处死，并迅速在冰台上分离出脑组织，冷冻后切成2mm厚的脑片，借助2%TTC溶液进行染色，在37℃恒温箱中孵育15~20min，全程避光操作，然后将脑片依次排列进行拍照，采用ImageJ软件对每张脑片的脑梗死体积百分比进行分析。

1.6.2脑缺血区皮层组织病理学改变

从各组剩余大鼠中再随机选出5只大鼠，麻醉后取出所需脑组织，多聚甲醛固定后，对其进行脱水、包埋、切片（5μm）、HE染色，最后在显微镜下观察缺血区大脑皮质的病理改变。

1.6.3血清中SOD活性、MDA含量

剩余每组5只大鼠在断头前收集腹主动脉血，并制成血清样本。使用WST-8法以及TBA法，严格按照试剂盒说明书配置工作液以及标准品，通过测定吸光度来计算血清中SOD活性以及MDA含量。

1.6.4脑缺血区皮层组织中ROS含量

取脑缺血区皮层组织，留下检测需要样本，剩余放入液氮罐中进行速冻，然后放置-80℃冰箱中，以备后续检测。脑组织严格按照试剂盒说明处理，通过DCFH-DA重悬，处理后的细胞沉淀用酶标仪检测荧光值，剩余上清液的蛋白浓度使用BCA法测定，脑缺血区皮层组织中ROS的相对表达水平通过荧光值与蛋白浓度之比表示。

1.6.5蛋白质印迹法（Westernblotting）检测脑缺血区皮层组织中相关蛋白表达量

取出20mg的皮层组织，完全裂解后，从样品中提取出总蛋白或者使用试剂盒提取核蛋白并且采用BCA法对蛋白质进行定量。将蛋白借助沸水浴进行变性，电泳后将凝胶取出，转印至PVDF膜上。使用脱脂奶粉封闭，TBS清洗。分别加入一抗（Ke⁃ap1抗体1∶1000、Nrf2抗体1∶1000、HO-1抗体1∶1000、NQO1抗体1∶1000），4℃冰箱封闭，过夜，P-BST洗膜，加入山羊抗兔IgGH&L（HRP）（1∶10000），室温孵育1h，P-BST洗膜，将印迹膜放置在成像分析仪上进行自动成像，并利用软件Image对蛋白条带灰度值进行分析处理。

1.7统计学处理

应用SPSS27.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠干预后神经功能学评分比较

见表1。干预结束后，模型组较假手术组大鼠，神经功能缺损评分升高（P<0.05）；依达拉奉组及通督灸组相较于模型组大鼠神经功能缺损评分都降低（P<0.05）；ATRA干预后，较之前大鼠神经功能缺损评分提高（P<0.05）；依达拉奉组与通督灸组大鼠在神经功能缺损评分上差异无统计学意义（P>0.05）。

表1各组大鼠干预后神经功能学评分比较

2.2各组大鼠脑梗死体积比较见表2、图1。

假手术组中，大鼠大脑染色均匀，没有出现梗死区域，而其余5组大鼠均观察到不同程度的白色梗死区域。相较于假手术组大鼠，模型组脑梗死体积百分比明显增加（P<0.05）；相较于模型组，依达拉奉组和通督灸组脑梗死体积均有减少（P<0.05）；施以ATRA干预后，大鼠脑梗死体积增加（P<0.05）；依达拉奉组与通督灸组大鼠之间差异无统计学意义（P>0.05）。

表2各组大鼠脑梗死体积比较

图1各组大鼠脑梗死情况

2.3各组大鼠脑缺血区皮层组织病理观察见图2。

在假手术组中并未观察到明显的病理性改变，神经元细胞排列规整，形态结构正常。模型组可观察到显著的病理改变，神经元细胞排列紊乱且稀疏，胞质染色不匀称，出现核皱缩，核仁深染，大量空泡结构，细胞周围的间隙增宽，有水肿现象。依达拉奉组以及通督灸组，神经元细胞排列相对较整齐，胞体变形减少，细胞周围间隙较为正常，有少量细胞存在核皱缩、核仁深染以及空泡现象，较模型组有明显改善，施以ATRA干预后较之前损伤加重。

图2各组大鼠大脑皮质组织病理观察

2.4各组大鼠氧化应激反应相关指标的表达水平比较见表3。

相较于假手术组，模型组大鼠血清中SOD活性下降，血清MDA含量以及脑缺血区皮层组织中ROS含量上升（P<0.05）；相较于模型组，依达拉奉组及通督灸组血清中SOD活性提升，血清MDA含量以及脑组织中ROS含量下降（P<0.05）；给予ATRA抑制剂干预后，较之前血清中SOD活性降低，血清MDA含量以及脑组织中ROS含量升高（P<0.05）；依达拉奉组与通督灸组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。

表3各组血清SOD活性、MDA含量以及脑组织ROS含量比较

2.5各组大鼠脑缺血区皮层组织中相关蛋白表达比较见表4、图3。

与假手术组相比，模型组大鼠脑缺血区皮层组织中Keap1蛋白表达下降，胞核Nrf2/Nrf2、HO1、NQO1蛋白表达上升（P<0.05）；相较于模型组，依达拉奉组和通督灸组Keap1蛋白表达进一步减少，胞核Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达进一步增加（P<0.05）；给予ATRA干预后，大鼠Keap1蛋白表达升高，胞核Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达降低（P<0.05）；依达拉奉组与通督灸组大鼠相比，差异无统计学意义（P>0.05）。

表4各组大鼠Keap1、胞核Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达比较

图3各组大鼠脑缺血区皮层组织中相关蛋白表达

3、讨论

CIR造成的损伤极大且不可逆，该损伤过程的病理机制由氧化应激反应、炎症反应、细胞凋亡、能量生成以及代谢障碍等不同方面共同参与［15］，CIR损伤发生后大脑内的氧化应激会导致神经元受损，引发细胞凋亡甚至死亡［16］。Keap1/Nrf2/ARE信号通路在调控机体内氧化应激反应中起到了关键作用，是一条用来抵抗内外界氧化损伤的防御性传导通路，有助于维持机体内氧化与抗氧化的平衡，并且在ROS的清除工作中发挥作用。人体正常生理状态下，Keap1与Nrf2相互结合，并且通过泛素-蛋白酶体途径降解Nrf2，使得Nrf2的表达稳定在低水平，进而抑制Nrf2/ARE通路的激活。在CIR损伤发生之后，大脑中ROS生成增多，氧化应激损伤加重，Keap1与Nrf2发生解离，进而导致Nrf2在细胞内不断蓄积并向核内转位，与抗氧化反应元件（ARE）结合，从而激活了下游包括HO-1、NAD（P）H醌氧化还原酶-1（NQO1）在内的多种抗氧化酶的表达，以发挥其抗氧化作用，减轻大脑内的氧化应激损伤，起到保护的作用［17］。

督脉为阳脉之海，主一身之元阳，与脊髓、脑有着紧密的联系。艾灸具有行气散寒、温通经络等多种功效，其温热效应能够透过穴位深入肌肉深层，从而扩张血管，促进血液循环，在临床治疗中风及其后遗症中得到了广泛的应用［18］。近年来，集督脉扶阳、隔姜铺灸、药物透皮吸收以及灸法标准化等多种思想，发展出一种新的艾灸手段，称为通督灸，故开展本实验研究通督灸对于急性CIR大鼠的疗效及其作用机制。

CIR损伤发生之后，大脑内生成大量ROS，ROS可通过导致胞膜中脂质过氧化、酶被氧化失活等方式损害脑细胞，甚至造成脑死亡。SOD、MDA是机体内反映氧化应激反应的重要指标，SOD反映的是机体对自由基的清除能力，MDA反映的是机体受自由基侵害的程度［19］。通过本研究发现，通督灸能明显改善急性CIR大鼠的神经功能评分、脑梗死体积百分比，并且使得CIR大鼠脑组织中ROS表达下调，血清中SOD活性增加，MDA含量下降，脑组织中胞核Nrf2表达上调，下游HO-1、NQO1抗氧化酶的表达升高。在ATRA干预后，该治疗作用被减弱，提示通督灸可能通过上调Keap1/Nrf2/ARE信号通路来改善急性CIR大鼠大脑的氧化应激损伤。综上所述，通督灸可能通过上调Keap1/Nrf2/ARE信号通路来减轻急性CIR大鼠大脑内的氧化应激损伤，改善大脑神经功能，发挥治疗作用。但是本研究还比较局限，CIR损伤的机制复杂，Nrf2基因涉及通路众多，关联炎症、凋亡、血管生成等很多方面，还可以继续深入研究与其他机制的关联。

参考文献:

[4]王剑,韩书清,周晓飞.Keap1/Nrf2/ARE途径通过抗氧化对大鼠脑缺血再灌注神经元损伤的作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(12):3038-3042.

[5]张润琛,马雅婧,刘博涵,等.艾灸预处理防治缺血性卒中作用机制的研究进展[J].辽宁中医杂志,2025,52(1):203-208.

[6]蒋洁,刘娟,于燕艳,等.灸法预处理减轻脑缺血再灌注模型大鼠氧化应激损伤的机制[J].中国组织工程研究,2024,28(16):2488-2493.

[8]袁之鹏,吕鹤群,曾春利,等.电针调节外泌体miR-210对脑缺血后HIF-1α/VEGF/Notch信号通路的影响[J].中华中医药学刊,2025,43(2):158-164,后插31-后插35.

[10]罗佳,吴宇,刘京东,等.香叶醇通过调控Nrf2/HO-1途径调节氧化应激减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤[J].中国药理学通报,2024,40(3):431-439.

[11]李秋霞,王广谋,陈健,等.橙皮素调节Keap1/Nrf2/ARE信号通路对D-半乳糖诱导的白内障大鼠氧化应激损伤的影响[J].河北医学,2023,29(2):195-200.

[12]张天生,刘晓波.通督灸操作规范及临床应用[J].中国民间疗法,2020,28(24):33-36,136.

[13]李忠仁.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社,2003:255-257.

[14]诺明,陶慧,哈森塔娜,等.舒芬太尼对心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及Bcl-2､LC3Ⅱ､Beclin-1表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2020,18(1):50-54.

[18]于燕艳,杨越,蒋洁.艾灸预处理通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路减轻脑缺血再灌注损伤大鼠炎性反应[J].针刺研究,2024,49(3):238-246.

基金资助:张捷省级名中医传承工作室建设项目(SXSMZYGZS130);山西中医药大学科技创新团队(培育)(2022TD2001);山西省中医药管理局科研课题(2024ZYY2B008);

文章来源:陈雪妮,秦静,张向悦,等.通督灸调节Keap1/Nrf2/ARE信号通路对急性脑缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的影响[J].中国中医急症,2025,34(07):1148-1151+1174.