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低剪切力下当归补血汤应用于内皮祖细胞功能损伤的保护作用

2020-08-11 141 上传者：管理员

摘要：目的：观察低剪切力作用下当归补血汤对内皮祖细胞功能的影响及调控机制。方法：分离培养大鼠骨髓EPCs并鉴定,将EPCs随机分为6组:正常SS组和低SS组(M199培养液培养2h)、辛伐他汀组(0.1μmol•L-1的辛伐他汀培养2h)、当归补血汤高、中、低浓度组(分别予以3.2g•L-1,1.6g•L-1,0.8g•L-1的当归补血汤培养2h),培养结束后弃上清,正常SS组加载1.2Pa的正常SS,余各组加载0.12Pa的低SS,分别在第30、60、360min检测EPCs的增殖、迁移和成小管功能、一氧化氮分泌、一氧化氮合酶mRNA及蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt)的表达。结果：与正常SS组比较,低SS组EPCs功能随时间延长而受损,细胞分泌NO及表达eNOSmRNA、Akt蛋白在60min时迅速上调(P<0.01),随后在360min时显著降低;与低SS组比较,辛伐他汀和当归补血汤高、中浓度可促进360min时的细胞功能和NO分泌,上调eNOSmRNA及Akt蛋白的表达(P<0.05)。结论：当归补血汤可通过调节NO/eNOS/Akt通路来保护低SS作用下受损的EPCs功能。

关键词：
内皮祖细胞
剪切力
功能
当归补血汤
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血液流体剪切力作为一种血流与血管壁摩擦产生的切应力,已被证实在血管内皮功能调节中发挥了不可忽略的作用,既往研究表明[1,2]低于0.4Pa的SS作用下,血管内皮功能会紊乱失调并出现动脉粥样硬化血管损伤;当血管内皮损伤时,可刺激骨髓内皮祖细胞动员并释放进入外周血,EPCs通过迁移、增殖和分化等步骤来参与受损血管内皮的更新修复[3],然而,EPCs的这些功能是否也会受到低SS影响?当归补血汤(以下简称补血汤)由当归和黄芪两味中药组成,前期研究[4]显示当归补血汤具有较好保护EPCs功能的作用,但这种保护效用是否也会受到低SS的影响?为此,本实验拟模拟体内低SS环境,观察EPCs功能的变化及当归补血汤的调节效果。

1、材料与仪器

1.1动物与材料

SD大鼠30只,体质量(200～220)g,雌雄各半,贵州医科大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(黔)2018-0001。M199培养液(批号NAA1326,美国Hyclone公司);大鼠骨髓单个核细胞分离液(批号TBD2013CR,天津灏洋生物科技有限公司);Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(批号YB-0013,广州奕源生物科技有限公司);FITC标记的荆豆凝集素1(FITClabeledUlexeuropaeusagglutinin-1,FITC-UEA-1)(批号055M4077V,美国Sigma公司);血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,6FGF)(批号011210、081308,美国PeproTech公司);一氧化氮(nitricoxide,NO)测定试剂盒(批号A012-1,南京建成生物工程研究所);Trizol(批号87843,美国Invitrogen公司);体外血管生成试剂盒(批号2576314,美国Corning公司);荧光定量PCR试剂盒(批号1833420,美国Biorad公司);兔抗大鼠Akt多克隆抗体(批号ab64148,美国Abcam公司)。

1.2药物

辛伐他汀(纯度98%,美国sigma公司),当归(批号20180102)和黄芪(批号20180603)均购于贵州百灵药业有限公司,由贵州医科大学药学院龙庆德教授鉴定为道地药材,当归补血汤由黄芪60g和当归12g组成,由贵州医科大学药学院采用回流提取法提取水溶物,微滤后,采用超滤膜分离纯化,用M199培养液溶解,配置为含生药32g/L的当归补血汤培养液,微孔滤膜除菌后,调整pH值为7.2,冷藏备用。

1.3主要仪器

BT600-2J精密蠕动泵(河北保定兰格恒流泵有限公司);平行平板流动小室(贵州医科大学生物医学工程学院提供);PharMedNSF-51医用级蠕动泵软管(法国圣戈班公司);倒置荧光显微镜(Lecia公司);流式细胞仪(BD公司)。

2、方法

2.1加载SS装置[5,6]

加载SS装置由平行平板流动小室和灌流系统组成:流动小室中央有一个可放置标准规格的显微镜载玻片的凹槽,当蠕动泵运行时,可驱动软管内的培养液经入液口进入小室,在载玻片表面形成稳定的SS,再经出液口流出,如此往返循环,整个实验在37℃,5%CO2的培养箱中进行;SS的计算公式为:τ=6μQ/H2W,其中μ为液体黏度,Q为入口流量,H为流室高度(cm),W为流室宽度(cm),本实验中τ为0.12Pa,灌流液为M199培养液,其μ值为7.651×10-4Pa·s,根据公式算出Q值,以蠕动泵的转速调节Q值。

2.2培养鉴定大鼠骨髓EPCs及细胞分组

麻醉处死大鼠后,采用密度梯度离心法提取骨髓单个核细胞,用M199全培养基(含20%胎牛血清,10μg/LVEGF和bFGF)培养,收集培养至第7天的细胞,与Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1孵育后,封片,荧光显微镜下行EPCs的双染色鉴定。

将培养第7天的EPCs等量接种于粘附载玻片上,待铺满80%时,将细胞爬片随机分为6组:正常SS组和低SS组(予以M199培养液培养)、辛伐他汀组(予以0.1μmol·L-1的辛伐他汀培养)、补血汤高、中、低浓度组(分别予以3.2,1.6,0.8g·L-1的补血汤培养),各组培养2h后弃上清,将细胞爬片置于流动小室中,正常SS组加载1.2Pa的正常SS,余各组加载0.12Pa的低SS,于第30min、60min、360min取各组细胞及灌流液检测指标。

2.3检测细胞功能

采用噻唑蓝检测细胞增殖功能:将EPCs等量接种于96孔板中,加入M199培养液培养24h后,每孔加入5%的噻唑蓝溶液15μL,继续培养4h,离心弃上清,每孔再加入二甲基亚砜150μL,水平震荡10min后,于酶标仪570nm读取吸光值;transwell迁移小室检测细胞迁移功能:将等量的EPCs加入迁移小室的上室,下室加入含50mg·L-1VEGF的M199培养液,培养24h后除去上室残留的细胞,4%多聚甲醛固定30min,吉姆萨染色,随机选择5个视野(200×)计数迁移至下室的细胞;成血管试剂盒检测细胞成小管功能:冰上操作配置Matrigel(基质胶),加入96孔板,每孔50μL,放入培养箱30min使胶凝固,将EPCs等量接种于胶上,继续培养24h,随机选取5个视野(200×)计数长度为宽度的4倍以上的细胞。

2.4检测细胞分泌NO

收集各时间点的灌流液,离心取上清,按NO检测试剂盒操作说明,采用硝酸还原酶法测定NO含量。

2.5检测细胞eNOSmRNA表达

提取各组细胞RNA,先进行第一链DNA合成,采用20μL反应体系:5×PrimeScriptBuffer4μL,PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL,OligodTPrimer1μL,RNA1μg,加入RNaseFreedH2O使体积达到20μL,反应条件:37℃反转录15min,85℃5s终止反应。荧光定量PCR扩增,反应体系:SsoFastEvaGreenSupermix10μL,上游引物1μL,下游引物1μL,RNase/DNasefreewater6μL,cDNATemplate2μL;条件:95℃预变性30s后,95℃5s,60℃34s扩增40个循环。全部引物由上海生工设计并合成,β-actin上游引物:5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’,下游引物:5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGC-3’;eNOS上游引物:5’-GCTGTCTGCATGGACCTGGA-3’,下游引物:5’-TCCACGATGGTGACTTTGGCTA-3’,SDS软件模块分析mRNA的相对表达量。

2.6检测细胞Akt蛋白表达

收集并提取各组细胞总蛋白,BCA法测定浓度,配置SDS-PAGE胶,取等量蛋白进行电泳,转膜3h后,用5%的脱脂奶粉封闭,入兔抗大鼠Akt多克隆抗体(稀释500倍)和二抗,采用化学法发光,显影定影,以GAPDH为内参,分析目的蛋白条带的相对表达量。

2.7统计方法

计量资料采用x±s表示,采用SPSS18.0统计软件进行分析,方差齐性条件下,采用单因素方差分析法,组间比较采用LSD检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1大鼠骨髓EPCs的培养鉴定

大鼠骨髓刚分离的单个核细胞呈卵圆状,诱导培养7d后出现集落生长,细胞变为长梭形或铺路石样(图1);细胞与Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1孵育后,同时结合FITC-UEA-1和摄取Dil-ac-LDL的细胞为正在分化的EPCs(图2)。

图1大鼠骨髓EPCs分离培养(200×)

图2EPCs的培养鉴定(200×)

3.2低SS下当归补血汤对细胞功能的影响

与正常SS组相比,低SS组细胞各项功能随时间延长而降低,在360min时显著降低(P<0.05);与低SS组相比,辛伐他汀及补血汤高浓度预处理可促进360min时细胞的增殖、迁移和成小管功能(P<0.05),补血汤中浓度只能促进360min时细胞的迁移和成小管功能,对增殖功能无显著影响;补血汤低浓度对各时间点细胞各功能均无显著影响。见表1～3。

表1低SS下当归补血汤对细胞增殖功能的影响(x¯±s)

表2低SS下当归补血汤对细胞迁移功能的影响(x¯±s)

表3低SS下当归补血汤对细胞成小管功能的影响(x¯±s)

3.3低SS下当归补血汤对细胞分泌NO的影响

与正常SS组相比,低FSS组细胞分泌NO在60min时显著增多(P<0.01),随后在360min时又降低;与低SS组相比,辛伐他汀及当归补血汤高、中浓度可显著促进360min时细胞的NO分泌(P<0.01),补血汤低浓度对各时间点NO分泌无明显影响。见表4。

表4低SS下当归补血汤对细胞分泌NO功能的影响(x¯±s)

3.4低FSS下当归补血汤对细胞eNOSmRNA表达的影响

与正常SS组相比,低FSS组细胞表达eNOSmRNA在60min时显著上调(P<0.01),随后在360min时明显降低。与低SS组相比,辛伐他汀及当归补血汤高、中浓度可显著促进360min时细胞eNOSmRNA的表达(P<0.05),补血汤低浓度对各时间点eNOSmRNA表达则无明显影响。见表5。

表5低SS下当归补血汤对细胞eNOSmRNA表达的影响(x¯±s)

3.5低SS下当归补血汤对细胞Akt蛋白表达的影响

与正常SS组相比,低SS组细胞表达Akt蛋白在60min时显著上调,随后在360min时明显降低;与低SS组相比,辛伐他汀及当归补血汤高、中浓度预处理可促进360min时细胞Akt蛋白的表达,补血汤低浓度对各时间点蛋白表达无显著影响。见表6,图3。

表6低SS下当归补血汤对细胞Akt蛋白表达的影响(x±s)

图3低SS下当归补血汤对细胞表达Akt蛋白的影响

4、讨论

EPCs是一类具有巨大增殖潜力的内皮细胞前体细胞,主要定居于骨髓,当血管内皮发生损伤时,其释放的某些刺激因子会促使EPCs从骨髓释放入外周血,迁移到血管损伤部位,黏附、结合到受损内皮,增殖分化为成熟内皮细胞,参与血管内皮的修复更新[3]。然而,EPCs的功能受体内诸多因素的影响,其中,血流SS就是影响EPCs不可忽视的因素。机体大、中动脉几何形状规则处血液呈稳定层流,产生生理性SS,平均大小约为1.2Pa,具有促进EPCs增殖、成小管、NO分泌和eNOSmRNA表达的作用[7];而在动脉的弯曲、开口、分叉处,血流呈分流、湍流、返流等紊乱状态,产生的异常低SS会损害EPCs功能,本研究也显示了低SS下EPCs的功能随时间延长而出现明显受损。由于Akt的激活及其下游eNOS的磷酸化是EPCs合成NO的重要途径,而NO可促进EPCs的增殖、迁移及血管新生,本研究中低SS下EPCs的NO/eNOS/Akt通路先被短暂激活,后又被明显抑制,这表明低SS导致了EPCs功能调节的紊乱。

中医学认为低SS产生与气血不足,血脉瘀阻关系密切:气不足则推动无力,血行缓慢,血液瘀滞,表现为血小板集聚、全血及血浆黏度升高、纤溶活性降低、局部血流灌注降低等。冠心病、高血脂、高血压等血管内皮病变患者普遍存在着血液粘度高、局部血流量不足等低SS情况,通过运动、体外反博、主动脉内球囊反搏等非药物方式,可暂时增加心输出量及局部血流灌流改善调节SS,临床长期运用后可明显减轻心绞痛症状、调节血脂、降低平均血压[8,9]。当归补血汤出自李东桓《内外伤辨惑论》的记载,由当归1份和黄芪5份组成,具有益气、活血、补血的功效,药理研究显示[10,11]当归能明显抑制血小板聚集、提高红细胞的变形性等,黄芪能降低冠心病患者的血黏度、调节血脂、扩张冠脉、增加冠脉血供等,这些都可能通过调节血管半径、增加血流量、降低血粘度来调节局部低SS。既往研究表明[4]当归补血汤能保护并促进EPCs的增殖分化功能,本研究表明低SS下当归补血汤也能通过调节NO/eNOS/Akt通路来保护低SS下受损的EPCs功能,而当归补血汤是否能通过其益气活血补血的功效来改善体内低SS环境,提高低SS作用下EPCs对药物的敏感性来保护血管内皮,这还有待进一步的研究。

参考文献：

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秦臻,黄水清,刘刚.低剪切力下当归补血汤对内皮祖细胞功能损伤的保护作用[J].时珍国医国药,2020,31(01):23-26.

基金:国家自然科学基金(81373522);贵州省科技计划项目(黔科合LH字[2016]7380);广东省广州市科技计划项目(201803010047).