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镰形棘豆总黄酮对CCl4诱导的肝纤维化大鼠的作用机制研究

2024-07-19 49 上传者：管理员

摘要：目的探讨镰形棘豆总黄酮对四氯化碳诱发的肝纤维化（HF）大鼠的作用，以及对肝转化生长因子（TGF）-β/Smad信号通路的影响。方法将48只雄性大鼠随机分为正常组（腹腔注射花生油，灌胃给予0.9%NaCl）、模型组（腹腔注射40%CCl4花生油溶液诱导HF模型+灌胃给予0.9%NaCl）、阳性对照组(HF模型+灌胃秋水仙碱0.2 mg·kg-1)和低、中、高剂量实验组(HF模型+分别灌胃镰形棘豆总黄酮提取物100、200、400 mg·kg-1),每组8只，连续4周。用苏木精-伊红（HE）、Masson染色方法观察组织病理变化；检测血清肝功能、肝纤维化水平；检测血清炎症因子水平，用荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法测定肝中基因的表达水平。结果模型组大鼠肝组织病理损伤严重，大量炎症因子和胶原纤维堆积，而其余给药组均有不同程度缓解。正常组、模型组、阳性对照组和低、中、高剂量实验组的谷丙转氨酶水平分别为（49.28±12.44）、（5 885.42±948.37）、（4 454.60±489.27）、（4 650.47±843.53）、（3 761.75±887.30）和（3 544.90±1 066.75）μg·L-1,谷草转氨酶水平分别为（186.90±46.89）、（5 936.23±793.81）、（3 971.37±780.28）、（4 360.30±863.35）、（3 943.10±439.47）和（3 971.38±631.08）μg·L-1,透明质酸水平分别为（45.08±17.16）、（104.32±36.06）、（66.83±20.09）、（70.30±21.07）、（60.00±9.68）和（59.02±10.73）μg·L-1,层粘连蛋白水平分别为（23.13±3.89）、（60.85±13.66）、（35.67±9.92）、（39.98±9.39）、（36.55±12.21）和（34.68±24.83）μg·L-1,Ⅲ型前胶原水平分别为（24.98±5.34）、（82.58±30.14）、（40.70±16.14）、（51.08±23.21）、（43.60±12.48）、（44.20±11.66）μg·L-1,白细胞介素（IL）-1β水平分别为（37.63±1.24）、（46.10±3.23）、（39.22±2.36）、（41.33±0.93）、（40.25±2.04）和（39.18±2.23） pg·mL-1,肿瘤坏死因子-α水平分别为（314.58±20.56）、（383.71±16.97）、（349.00±7.93）、（348.88±25.11）、（325.75±27.84）和（335.07±21.33） pg·mL-1,TGF-β1 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.00、60.99±15.70、9.61±1.59、7.37±1.09、6.41±0.64和6.87±1.09,Smad7 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.00、0.34±0.05、0.21±0.03、 0.35±0.02、0.38±0.02和0.42±0.03。模型组的上述指标与正常组比较，中、高剂量实验组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。结论镰形棘豆总黄酮对CCl4诱导的大鼠肝纤维化具有保护作用，其机制可能与调节TGF-β/Smad通路有关。

关键词：
四氯化碳
总黄酮
肝纤维化大鼠
转化生长因子-β/Smad通路
镰形棘豆
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肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是肝对慢性损伤的病理性修复反应，是各种慢性肝病向肝硬化发展过程中的关键步骤和影响慢性肝病预后的重要环节[1,2]。疾病控制中心和全球疾病负担研究数据显示，慢性肝病及其并发症的发病率和影响在全球范围持续增加[3]。HF作为慢性肝病向肝癌、肝硬化发展的中心环节，与远期生存率息息相关，因此，治疗和逆转肝纤维化是肝病防治的关键。镰形棘豆(Oxytropis falcata Bunge)是青藏高原常用的民族药，抗炎作用显著，有“三大抗炎药之一”之称，黄酮类化合物是镰形棘豆的重要的活性物质[4]。赵兴辉等[5]发现，镰形棘豆总黄酮可改善乙型病毒性肝炎大鼠肝组织损伤，抑制其纤维化，保护其肝功能。本研究旨在建立大鼠HF模型，探讨镰形棘豆总黄酮对肝纤维化的作用及其作用机制，为其临床应用提供参考。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级SD雄性大鼠，4周龄，体质量(200±20) g, 购自中国农业科学院兰州兽医研究所。动物生产许可证号：SCXK(甘)2020-0002。本实验经兰州市食品药品检验检测研究院批准(伦理批号：2023-006)。

药品与试剂镰形棘豆，批号：20130901,购自西藏自治区那曲市嘉黎县，由西藏贝珠雅藏药材开发有限公司提供，经甘肃省第二人民医院马新换主任中药师鉴定药材为豆科棘豆属镰形棘豆的干燥全草。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)、马松(Masson)染色试剂盒，均由北京索莱宝科技有限公司提供；谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase, GPT)、谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase, GOT)测定试剂盒，均由北京安图生物工程有限公司提供；透明质酸(hyaluronic acid, HA)、层黏连蛋白(laminin, LN)和Ⅲ型前胶原(type Ⅲ procollagen, PC Ⅲ)测定试剂盒，均由天津博奥赛斯生物科技有限公司提供；白细胞介素(interleukin, IL)-1β试剂盒、IL-6试剂盒、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α试剂盒，均由上海机纯实业有限公司提供；Steady Pure RNA提取试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、SYBR® Green Pro Taq HS试剂盒，均购自艾科瑞生物科技有限公司；转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1、Smad3、Smad7、β-actin引物，均由艾科瑞生物科技有限公司设计与合成。

仪器Spectra多功能酶标仪，美谷分子仪器有限公司产品；BS-800全自动生化分析仪，深圳迈瑞生物医疗电子有限公司产品；PETECK96-1全自动化学发光测定仪，天津博奥赛斯生物科技有限公司产品；TC-96/G/HB(b)荧光定量仪，杭州博日科技有限公司产品。

2 实验方法

2.1 镰形棘豆总黄酮的提取

用乙醇浸渍法提取镰形棘豆总黄酮提取物[6]。提取后的总黄酮提取物以芦丁为对照品，用紫外分光光度计测定其纯度为63%。称取计算量的总黄酮提取物，用纯净水溶解，超声10 min使其充分溶解，配成实验所需的各剂量的总黄酮提取物混悬液。

2.2 模型构建[7]7]、动物分组与给药方法

将48只SD雄性大鼠适应性喂养1周，随机分为正常组、模型组、阳性对照组和低、中、高剂量实验组，每组8只。除正常组外其余各组均腹腔注射40%CCl4花生油溶液(1 mL·kg-1,首次注射2 mL·kg-1)以建立HF模型。正常组腹腔注射等量花生油，正常饮食、饮水。于造模第2天起，阳性对照组灌胃0.2 mg·kg-1秋水仙碱混悬液，低、中、高剂量实验组分别灌胃100、200、400 mg·kg-1镰形棘豆总黄酮提取物混悬液，正常组及模型组灌胃等体积0.9%NaCl, 每日1次，连续4周。末次给药后腹主动脉取血，处死大鼠取肝组织备用。

2.3 HE、Masson染色法检测病理组织[8]8]

肝组织用4%甲醛溶液固定，经过脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡后，分别进行HE和Masson染色，显微镜下观察肝组织病理变化。

2.4 全自动生化法测定肝功能和肝纤维化指标[9]9]

分别用全自动生化分析仪和全自动化学发光测定仪检测肝功能指标(GPT、GOT)和肝纤维化指标(HA、LN、PC-Ⅲ)水平。

2.5 ELISA法检测IL-1、IL-6、TNF-α水平[10]10]

按照ELISA试剂盒说明书设置空白孔、标准孔和样本孔，加入血清样本和酶标试剂后，37 ℃孵育60 min, 洗涤液洗涤5次，拍干，先后加入显色剂A、B和终止液，在加入终止15 min内，以空白孔调零，450 nm波长下测量各孔的光密度值。

2.6 实时定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, qRCR)法检测TGF-β1、Smad3、Smad7基因表达情况[11]11]

取于-80 ℃保存的肝组织，按照试剂盒提取RNA,用超微量分光光度计检测RNA浓度，SYBR Green进行qRCR反应，以β-actin为内参，检测TGF-β1、Smad3、Smad7基因的mRNA表达水平。使用2-△△ct法计算各组mRNA的相对表达水平。

3 统计学处理

用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 镰形棘豆总黄酮对血清肝功能和肝纤维化指标的影响

将大鼠随机分为正常组(腹腔注射花生油，灌胃给予0.9%NaCl)、模型组(HF模型+灌胃0.9%NaCl)、阳性对照组(HF模型+灌胃0.2 mg·kg-1秋水仙碱)和低、中、高剂量实验组(HF模型+分别灌胃100、200、400 mg·kg-1镰形棘豆总黄酮提取物)。

模型组与正常组比较，GPT、GOT、HA、LN、PCⅢ含量均显著升高(均P<0.001);阳性对照组和中、高剂量实验组GPT、GOT、HA、PCⅢ与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05, P<0.01, P<0.001);阳性对照组和高剂量实验组LN水平与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠血清肝功能和纤维化指标

表2 各组大鼠血清炎症因子指标

2 镰形棘豆总黄酮对血清炎症因子的影响

模型组与正常组比较，IL-6、IL-1β、TNF-α水平均显著升高(均P<0.001);阳性对照组和低、中、高剂量实验组IL-6、IL-1β水平与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05, P<0.01,P<0.001);与模型组比较，中、高剂量实验组TNF-α水平均显著降低(P<0.01, P<0.001),见表2。

3 肝组织病理学检查

HE染色结果显示：正常组大鼠肝结构正常，肝细胞排列整齐，有少量炎症细胞浸润；模型组大鼠肝细胞排列紊乱，可见大量的细胞空泡状变化和炎症细胞浸润，有假小叶形成；各给药组较模型组炎症细胞浸润、空泡状变化减少，其中高剂量实验组大鼠肝细胞排列变整齐，病变程度明显轻于其他给药组，见图1。

Masson染色结果显示：正常组未见明显胶原纤维增生；模型组中央静脉、窦周隙清晰可见胶原纤维延伸，大量细胞空泡变化，纤维组织增生，纤维间隔增宽；各给药组纤维组织增生减少，纤维间隔变薄，高剂量实验组纤维沉积和病变程度明显轻于其他组，见图2。

4 镰形棘豆总黄酮对肝mRNA表达的影响

模型组与正常组比较，大鼠肝组织中TGF-β1、Smad3 mRNA的表达水平均显著升高(P<0.05, P<0.001),Smad 7 mRNA表达水平显著降低(P<0.001);与模型组比较，各给药组TGF-β1 mRNA表达水平均显著降低(均P<0.001),中、高剂量实验组Smad3 mRNA表达水平均显著降低(均P<0.05),高剂量实验组Smad7 mRNA表达水平显著升高(P<0.05),见表3。

图1 各组大鼠肝组织苏木精-伊红染色(×100)

图2 各组大鼠肝组织Masson染色(×100)

表3 各组大鼠肝组织中mRNA相对表达情况

三、讨论

HF无法自愈，也很难治愈，但其在组织学上是可逆的，治疗的目的是阻止肝损伤，从而阻止HF向肝硬化发展的进程。在致纤维化因子中，TGF-β是最强的[12],HF发病的所有关键环节均与其相关。其中TGF-β1占比最高，活性最强，分布最广。TGF-β1与下游的Smad蛋白结合，形成TGF-β1/Smad信号通路，这是导致HF的主要通路，是逆转HF的关键[13]。炎症在整个纤维化过程炎症贯穿始终，是肝纤维化发展的关键环节之一。所以，抑制炎症的发生，减少炎症因子的刺激是阻止HF进一步发展的一条途径。本实验结果显示，藏药镰形棘豆总黄酮提取物能减轻肝损伤，改善肝组织病变，降低血清中IL-6、IL-1β及TNF-α等炎症因子，下调肝组织中TGF-β1、Smad3 mRNA的相对表达水平，上调Smad7 mRNA的表达水平。

本研究提示：镰形棘豆总黄酮提取物对CCl4诱导的肝纤维化大鼠具有保护作用，能延缓肝纤维化的进程。其保护作用可能是通过降低炎症因子水平、抑制TGF-β1/Smad信号通路激活，来抑制肝星状细胞的活化与增殖。

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