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炮制对木鳖子亚油酸和油酸的相对含量及指纹图谱的影响

2020-08-11 370 上传者：管理员

摘要：目的：研究炮制对木鳖子亚油酸和油酸的相对含量及指纹图谱的影响。方法：采用制霜法炮制10批不同产地的木鳖子；应用超高效液相色谱法对木鳖子生品、木鳖子霜中亚油酸和油酸两种成分进行含量测定，并比较其指纹图谱差异。结果：木鳖子炮制后其亚油酸和油酸相对含量明显增加，其中亚油酸含量较生品增加了6.97%，油酸含量较生品增加了15.85%；聚类分析结果显示，10批木鳖子生品聚为1类，10批木鳖子霜聚为1类；主成分分析图显示10批木鳖子生品与10批木鳖子霜分布在中轴线两端，互不交叉。结论：该方法建立的分析方法快速、稳定、重复性好；炮制对木鳖子的指标成分和UPLC指纹图谱均有不同程度的影响。

关键词：
UPLC
含量测定
指纹图谱
木鳖子
炮制
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木鳖子是葫芦科植物木鳖Momordicacochinchinensis(Lour.)Spreng.的干燥成熟种子，味苦、微甘，性凉；有毒，归肝、脾、胃经[1]。木鳖子作为中药使用，始载于《开宝本草》[2]，其具有散结消肿、攻毒疗疮的功效，临床常用于治疗疮疡肿毒、瘰疬、痔瘘、干癣、秃疮等，疗效确定[3]。木鳖子属于种子类中药，含油量丰富，具有一定刺激性与毒性，需要除油制霜后入药[4,5]。目前研究表明，木鳖子油中含有亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸，该类成分具有降低心血管疾病的发病率、防癌等活性[6,7]。本研究在课题组前期对木鳖子中皂苷类成分的含量及指纹图谱研究的基础上[8]，以脂肪油中亚油酸和油酸含量为主要考察指标，采用UPLC法比较木鳖子炮制前后的两种脂肪油类成分含量和UPLC指纹图谱变化，以期了解炮制对脂肪油类成分的影响，并为木鳖子炮制“减毒增效”及其进一步研究开发提供实验依据。

1、仪器与试药

1.1仪器

超高效液相色谱仪;ME55型十万分之一分析天平[梅特勒-托利（上海）有限公司]；KQ3200DB型超声仪（江苏昆山超声仪器有限公司）；KDC-16H高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2试药

亚油酸对照品（批号：DST180719-159）、油酸对照品（批号：DST170417-063）均购于成都德思特生物技术有限公司。10批不同产地的木鳖子药材经安徽中医药大学第一附属医院李立华主任中药师鉴定，均符合2015版《中国药典》木鳖子“鉴别”项下规定。甲醇、乙腈（Sigma公司）均为色谱纯；蒸馏水（屈臣氏公司）。

2、方法与结果

2.1木鳖子生品、木鳖子霜亚油酸和油酸相对含量测定

2.1.1木鳖子霜制备

根据2015版《中国药典》木鳖子项下炮制工艺，结合课题组前期实验基础，制备木鳖子霜。主要方法为：取一定量去除外壳的木鳖子种仁，置于真空干燥箱内，在80℃条件下加热一定时间后取出晾凉，适度粉碎后用草纸包裹放置于榨油机内，压制至草纸上不再出现油渍为止，即得木鳖子霜。

2.1.2色谱条件

LunaOmegaPolarC18色谱柱（2.1mm×100mm,1.6μm）；柱温为30℃；检测波长为203nm；流速为0.25mL/min。流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱程序如下：0～3min,3%～15%A;3～13min,15%～45%A;13～20min,40%～100%A;20～22min,100%A;22～23min,100%～3%A;23～25min,3%A。

2.1.3对照品溶液制备

精密称取亚油酸、油酸对照品适量，配制成一定浓度的对照品母液；再取一定量对照品母液，加甲醇配制成亚油酸浓度为0.157mg/mL，油酸浓度为0.025mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.4供试品溶液制备

分别取10批不同产地的木鳖子生品与木鳖子霜，粉碎，过60目筛，精密称定3g木鳖子生品与木鳖子霜，置于索氏提取器中，于提取瓶中加入60%乙醇100mL，在85℃条件下水浴回流提取4h。将提取后的样品倒入已称重的蒸发皿中，置于水浴锅中85℃条件下水浴蒸干溶剂，取出放凉。将所得残渣移至10mL的容量瓶内，加甲醇至刻度。重复制备过程，共得10批不同产地木鳖子生品和木鳖子霜样品溶液。取样品溶液1.5mL，于12000r/min条件下离心10min，取上清液，上清液过0.2μm滤膜供UPLC分析用。

2.1.5方法学考察

2.1.5.1线性关系考察

分别精密吸取“2.1.3项”下的混合对照品溶液于容量瓶中，加甲醇配制成不同系列浓度的溶液，依次进样，并按“2.1.2项”下的色谱条件对峰面积进行测定，并以亚油酸、油酸浓度（μg/mL）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得到其标准曲线，计算回归方程，其中亚油酸回归方程为Y=114211X-45222(r=0.9997），在0.157～0.942μg/mL范围内线性关系良好；油酸回归方程为Y=37940X-18993(r=0.9997），在0.025～0.150μg/mL范围内具有良好线性关系。表明其线性范围良好。

2.1.5.2精密度实验

精密吸取混合对照品溶液2μL，按“2.1.2项”下色谱条件重复进样6次，测定亚油酸、油酸峰面积，计算精密度。结果显示RSD值在0.65%～0.97%之间，表明仪器精密度良好。

2.1.5.3稳定性试验

精密称取S16号样品6份，按照“2.1.4项”下方法处理，在“2.1.2项”条件分别于0h、4h、8h、12h、16h、24h定时进样测定，记录峰面积，计算RSD值，结果显示RSD值在1.59%～2.14%之间，表明至少在24h内，样品溶液稳定。

2.1.5.4重复性实验

精密称取S19号样品6份，按照“2.1.4项”下方法处理，在“2.1.2项”下色谱条件进样，对供试品中亚油酸、油酸两种成分的峰面积进行记录，计算两种指标成分含量，计算得其RSD值在0.67%～0.83%之间，表明供试品重复性良好。

2.1.5.5加样回收率实验

取S12号样品，加入与样品中成分含量接近的对照品溶液，按照“2.1.4项”下方法制备加样回收样品溶液6份，按“2.1.2项”下色谱条件进样，计算各成分的加样回收率[回收率（%）=（测得量-样品含量）/加入量×100%]。结果亚油酸加样回收率为107.68%，平均RSD为0.87%；油酸加样回收率为104.04%，平均RSD为1.41%。表明木鳖子中两种成分回收率良好。

2.1.5.6含量测定

取木鳖子生品和木鳖子霜各10批样品的供试品溶液，按照“2.1.2项”下条件进样，如图1所示，两种指标成分与其他成分分离度较好，按外标法计算亚油酸、油酸的含量，结果见表1、表2。

表1木鳖子中亚油酸、油酸含量测定结果

表2木鳖子炮制前后指标成分平均含量比较

图1亚油酸、油酸混合对照品与样品UPLC图谱

由表1、表2可以看出，木鳖子制霜后，其中亚油酸和油酸的相对含量均有所增加，亚油酸和油酸相对含量增加率分别为6.97%和15.85%。

2.2木鳖子生品、木鳖子霜UPLC指纹图谱

2.2.1样品制备、对照品溶液制备、供试品溶液制备

制备方法同2.1.1、2.1.3、2.1.4项。

2.2.2方法学考察

2.2.2.1精密度实验

精密称取S12号样品6份，按照“2.1.4项”下方法制备6份木鳖子供试品溶液，在“2.1.2项”下方法自动进样器连续进样6次，记录其图谱；结果表明，测得的色谱指纹图谱与其共有模式图谱的相似均大于0.999（中位数），22个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值分别在0.003%～0.117%和0.531%～4.687%之间，表明仪器精密度良好。

2.2.2.2稳定性实验

精密称取S16号样品6份，按照“2.1.4项”下方法制备6份木鳖子供试品溶液，在“2.1.2项”下方法进样测定，时间间隔为0h、4h、8h、12h、16h、24h。结果显示在同一台仪器测得的色谱指纹图谱与其共有模式图谱的相似度大于0.999（中位数），22个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值分别在0.046%～0.195%和1.587%～5.177%之间，表明在24h内供试品溶液稳定性良好。

2.2.2.3重复性实验

精密称取S19号样品6份，按照“2.1.4项”下方法制备6份木鳖子供试品溶液，按“2.1.2项”下色谱条件，分别进样，将采集的指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件2012(A版）”，考察各份样品色谱峰保留时间的一致性，计算其相似度，结果表明6份样品的相似度均大于0.999（中位数），22个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值分别在0.006%～0.094%和0.675%～4.828%之间，表明样品的重复性较好。

2.2.3木鳖子指纹图谱中的共有峰确定

取20批木鳖子供试品溶液，按“2.1.2项”下方法依次进样检测，根据指纹图谱的检测结果，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004(A版）”，生成木鳖子共有模式的对照指纹图谱，共确定了22个共有色谱峰，通过与对照品比对，确认了2个色谱峰，分别为亚油酸（19）、油酸（20），共有模式色谱图结果见图2,22个色谱峰的保留时间和相对峰面积见表3、表4。

由表3和表4结果可见，木鳖子炮制前后的相对峰面积分别在0.538～11.294、0.360～6.077之间，RSD变化分别在33.79%～122.21%、0.28%～61.97%之间，木鳖子炮制前后脂肪油成分总体变化明显。

表310批木鳖子生品指纹图谱相对峰面积

表410批木鳖子霜指纹图谱相对峰面积

图3木鳖子生品与木鳖子霜UPLC指纹图谱

由表5结果可以看出，木鳖子生品与木鳖子霜的脂肪油成分相似度较好，其值均大于0.996。

2.3样品的聚类分析

为更直观比较其炮制前后的差异，采用SIMCA13.0.3软件，对10批木鳖子生品，10批木鳖子霜样品进行聚类分析。其中S(1～10）为木鳖子生品，P(1～10）为木鳖子霜，结果见图4。通过聚类分析结果树状图可明显看出，20批木鳖子样品分为两类，其中S1～S10聚为一类，P1～P10聚为一类，即木鳖子生品为一类，木鳖子霜为一类。

图420批木鳖子样品聚类分析结果树状图

2.4样品的主成分分析

运用SIMCA13.0.3软件对20批木鳖子样品进行主成分分析，分析结果见图5，其中S(1～10）为10批不同产地木鳖子生品，P(1～10）为10批不同产地木鳖子霜，图中每个点代表一个木鳖子样品。由主成分分析图可清晰地看出，S(1～10）距离相近，P(1～10）距离相近，20批样品分布在中轴线两端，互不交叉。结合聚类分析结果，可说明木鳖子生品与木鳖子霜在整体上存在一定差异。

图520批木鳖子主成分分析图

3、讨论

本研究根据课题组前期工作及查阅相关参考文献对样品进行了全波长扫描，最终显示203nm波长下的图谱信息量较多，各色谱峰的峰形良好，基线平稳。同时，本研究考察了不同色谱柱对色谱峰形的影响，结果显示样品在LunaOmegaPolarC18(2.1mm×100mm,1.6μm）色谱柱条件下峰形良好。此外，本研究还考察了不同流动相系统的梯度洗脱条件、柱温条件等对实验的分离度等影响，经过优化，最终选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相，柱温30℃，色谱柱为LunaOmegaPolarC18(2.1mm×100mm,1.6μm）作为本研究的色谱条件。在此色谱条件下各色谱峰的峰形及分离度较好，且基线平稳，得到了含量测定和指纹图谱分析的较佳条件。在实验结果的分析上不仅以常用的相似度比较，还结合聚类分析和主成分分析等手段，更进一步说明了炮制前后样品脂肪油部位的质量差异。

临床上，木鳖子多用于肿瘤患者辅助治疗，其单味药和复方制剂均具有一定疗效。研究表明，木鳖子所含脂肪油对人体具有调节平衡的作用，在降血脂、抗肿瘤及免疫调节方面起到重要作用，其中亚油酸和油酸为脂肪油中已知的主要成分，且具有抗炎、降低心脑血管疾病及抗肿瘤等作用[9,10]。但是，其脂肪油类成分又具有一定的刺激性和毒性，因此需要炮制去油制霜以达到“减毒增效”的目的。目前还未见有炮制对亚油酸和油酸含量及脂肪油的指纹图谱影响的研究报道。因此，本研究选择木鳖子脂肪油部位为研究对象，对其炮制前后亚油酸和油酸的含量变化及指纹图谱进行研究。结果显示，木鳖子制霜后其亚油酸和油酸相对含量升高，脂肪油部位的指纹图谱色谱峰变化明显，为其炮制前后质量变化提供了部分依据。由于目前可获得的脂肪油对照品较少，本研究只鉴定了亚油酸和油酸2个成分，而炮制前后脂肪油类成分的归属及脂肪油对药效、毒性的影响等还有待进一步研究。

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基金:安徽省自然科学基金项目(1708085MH196);2015年中医药部门公共卫生专项资金“中药炮制技术传承基地建设”项目;安徽中医药大学科研基金自然重点项目(2018zrzd14).