衰老是不可抗拒的生理过程，随着年龄增长，身体机能逐渐减弱，更重要的是出现记忆力下降、学习认知能力下降、表达力下降等多种症状，即“脑衰老”。海马结构和功能的改变影响人们的学习和记忆功能[1]。脑源性神经营养因子(BDNF)是重要的营养因子，可特异性结合其受体酪氨酸激酶B(TrkB)发挥一系列生物学效应，而BDNF水平随年龄增长而下降，是评价神经退行性疾病的重要指标[2,3],也是评价衰老程度的一项重要指标。

氧化应激假说认为，在生物体衰老过程中，机体组织细胞不断产生的自由基得不到及时清除，逐渐积累，由于自由基反应能力较强，可氧化细胞中的多种物质，损伤生物膜，造成蛋白质等大分子交联，因而影响其正常功能，加速机体衰老进程[4,5,6,7]。

水杨梅(Adina rubella Hance)为茜草科水团花属植物，具有清热利湿、解毒消肿的功效。水杨梅含有多种成分，包括黄酮类化合物、三萜类化合物、多酚化合物、生物碱等，杨秀芳等[8]研究表明，从水杨梅分离纯化得到的黄酮醇类化合物具有良好的抗氧化活性。但该项目仅分离纯化得到了6种黄酮类化合物，课题组考虑水杨梅含有的黄酮类成分包含但不局限于6种。为进一步明确水杨梅中所有发挥抗氧化作用的黄酮类成分，课题组从水杨梅总黄酮入手，展开系列研究，以期可逐一分离出水杨梅抗氧化的黄酮类成分。

前期课题组通过大孔树脂法收集水杨梅总黄酮(ZHT)纯化提取液，采用DPPH法、ABTS法和铁还原法，已证实其有一定程度的体外抗氧化能力[9],而其是否具备体内抗氧化能力，是否因发挥体内抗氧化作用，进而改善衰老小鼠的认知功能，达到延缓衰老的目的，特开展本研究，并通过本研究，为今后单体分离纯化奠定理论基础。通过给药干预，比较模型组与正常组，模型组与给药干预组小鼠的行为学变化，海马病理形态的变化，海马组织匀浆SOD、GSH-Px、MDA水平变化，海马组织中BNDF及TrkB表达量的变化，明确ZHT抗氧应激能力及其对衰老小鼠认知功能的影响作用。

1、材料与方法

1.1 主要试剂

SYBR FAST QPcr Master Mix(KAPA Biosystems, 货号：KM401);Oligo(dT)18 Primer (KAPA Biosysterms, 货号：3806);PrimeScriPt Ⅱ RTase(TAKAPA,货号：2690A);Recombinant Rnase Inhibitor(TAKAPA,货号：2313A);10 mM dNTP Mix(solarbio, 货号：PC2200);DNase/RNase-Free Water(solarbio, 货号：R1600);氯仿(国药集团化学试剂有限公司，货号：10006818);异丙醇(国药集团化学试剂有限公司，货号：80109218);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，货号：10009218);伊红(Solarbio, 货号：E8090)、中性树脂(Solarbio, 货号：G8590)、苏森素(Solarbio, 货号：G1140);Trizol(ambion, 货号：15596026);MDA试剂盒(批号：20200305)、SOD 试剂盒(批号：20200705)、GSH-Px 试剂盒(批号：20190324),以上试剂盒均购自南京建成生物研究所。

1.2 仪器

超净工作台(SW-CJ-2D型，苏州 净化);高压灭菌锅(YM75,上海，三申);微量移液枪(各种型号，美国，Rainin PiPet-Life);高速冷冻离心机(Icen-24R,杭州，奥盛);PCR仪(GE48527,杭州，柏恒);荧光定量PCR仪(CFX-Connect 96,Bio-Rad);冰箱(BCD-330L4GY,中国，KONKA);鼓风干燥箱(DHG-9240A,上海一恒);微量涡旋混合仪(MTV-1,杭州，奥盛);实验室超纯水器(ROS-S15,武汉，吉百瑞);超微量分光光度计(Nano-300,杭州，奥盛);正置显微镜(徕卡显微系统有限公司，DM1000)、移液器(吉尔森P型称器公司，P2、P10、P20、P100、P200、P1000)、恒温烘箱(上海一恒科学有限公司，DHG-3023A)、石蜡切片机(俫卡显微系统有限公司，RM2235)、摊片烤片机(湖北康强医疗器械有限公司，TKD-TK)、生物组织包埋机-冷冻机(泰维科技，TB-718L)、生物组织包埋机(泰维科技，TB-718D)、自动组织脱水机(湖北康强医疗器械有限公司，TKD-TSF),Morris 水迷宫记录仪购自中国医学科学院药物研究所。

1.3 实验动物

雄性普通级小鼠60只，体质量(31.5±3.3)g, 6个月龄，购自广西医科大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK(桂)2014-0002。饲养于动物房，标准饲料喂养，动物饲养条件：温度(25±2)℃,相对湿度(60±10)%,自由饮食饮水。

1.4 药物

水杨梅总黄酮提取物(总黄酮23 mg/mL,批号：20201013,柳州市中医医院中药壮瑶药制剂研发重点实验室);茴拉西坦片(阳性对照药，批号：国药准字H20000548,亚宝药业);D-半乳糖(批号：170512,Sigma公司)。

1.5 模型制备[10,11,12]10-12]及动物分组

60只雄性小鼠适应性喂养1W后，随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、ZHT高、中、低剂量组，每组10只。根据体质量计算给药体积(0.1 mL/10 g)。空白对照组小鼠每日于颈背处皮下注射0.9%生理盐水，模型组、阳性对照组、ZHT高、中、低剂量组小鼠每日于颈背处皮下注射300 mg/kg的D-半乳糖。模型组、阳性对照组每日D-半乳糖造模后灌胃同体积生理盐水，ZHT高、中、低剂量组每日D-半乳糖造模后分别灌胃ZHT 92 mg/100 g、46 mg/100 g、23 mg/100 g, 阳性对照组灌胃茴拉西坦片4 mg/100 g, 实验进行8 W。

1.6 检测指标

1.6.1 行为学评价

于末次给药前10 d进行Morris水迷宫[13]、避暗实验[14]、跳台实验[15]。Morris水迷宫：实验过程包括定位航行实验和空间探索实验两部分，定位航行实验进行5 d, 在水池中第Ⅱ象限的中心位置放置平台，每天依次于每个象限训练每只小鼠，若小鼠60 s内未能找到平台，则将小鼠引导至平台上，其潜伏期为60 s, 完成逃避潜伏期实验。在末次定位航行实验结束24 h后进行1次空间探索实验，撤掉平台，随后将小鼠面向池壁放入水中，入水口选择平台对面的象限，时间为60 s, 计算平台象限逗留时间(t3)与总时间(t总)的比值(%)。

避暗试验：避暗实验第1日，避暗法训练小鼠学习能力，暗室通以33 V电压，将小鼠放入明室，趋暗习性使小鼠奔向暗室，受到电击后马上逃回明室，如此训练5 min。避暗实验第2日进行记忆测试，以进入暗室为错误反应，以每只鼠从放入明室至进入暗室遇到电击所需的时间为潜伏期，记录5 min内的穿梭次数和首次进入暗室的潜伏期，并进行统计学处理。

跳台试验：将小鼠放入反应箱内先适应环境3 min, 然后再将小鼠放置于反应箱内的铜栅上，立即通以36 V的交流电，如此训练5 min。24 h后为测试阶段。记录小鼠第1次跳下高站台的时间即为跳台潜伏期时间，3 min内受到电击的次数即错误次数。

1.6.2 小鼠海马组织病理学检查

行为学实验结束后，以10%水合氯醛腹腔注射以麻醉小鼠，解剖小鼠全脑放入4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，冠状切片，HE染色，光学显微镜观察海马神经组织形态及结构变化。

1.6.3 小鼠海马组织匀浆SOD、GSH-Px活性及MDA含量检测

麻醉小鼠后迅速取出脑组织，用冷生理盐水清洗干净，于冰上收集海马组织，用生理盐水按质量比(1∶9)将海马组织制成10%组织匀浆，取上清，先将海马组织上清液进行定量，再根据试剂盒说明书进行SOD、GSH-Px活性及MDA含量检测。

1.6.4 实时荧光定量RT-PCR法检测海马组织中BDNF和TrkB mRNA表达

取血后，断头取脑，冰上分离海马，并将海马分为左右两页分装，置液氮速冻后转移至-80 ℃冰箱。称取左侧海马组织，剪碎并加入trizol 1 mL,置组织研磨仪研磨，使用高速冷冻离心机以12 000 r·min-1离心15 min(离心半径10 cm, 下同),取上清液，加入三氯甲烷200 μL,再次以12 000 r·min-1离心15 min, 取上清液，加入甲醇400 μL,瓶底白色絮状物即为mRNA。使用逆转录试剂盒将各样本逆转录以合成cDNA,加样过程参照逆转录试剂盒说明书；使用荧光定量试剂盒加样后，置PCR仪进行实时荧光定量扩增，扩增条件为95 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、65 ℃ 30 s、95 ℃ 10 s, 共进行40个循环，于65～95 ℃绘制溶解曲线。计算PCR反应过程中的Ct值，以2-ΔΔCt表示mRNA相对表达水平。BDNF、TrkB及内参基因序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.7 统计学方法

实验数据均采用SPSS 18.0 统计软件进行处理，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 杨梅总黄酮对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响

2.1.1 Morris 水迷宫行为学检测结果

与正常组比较，训练第5日时，模型组小鼠行动路线仍旧杂乱无章，逗留平台象限时间(t3) 占总时间(t总) 的比值减少( P<0.05),穿越平台次数减少(P<0.05);与模型组比较，ZHT给药组平台象限逗留时间占总时间的比值增加(P<0.05),穿越平台次数亦增加(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组空间探索实验结果比较

2.1.2 避暗实验、跳台实验检测结果

与对照组相比，模型组避暗及跳台潜伏期缩短，避暗及跳台错误次数明显增加(P<0.05)。与模型组相比，ZHT各剂量组和茴拉西坦阳性组避暗潜伏期、跳台潜伏期均延长，避暗次数均明显减少，跳台错误次数均减少(P<0.05),表明ZHT可提高衰老小鼠的学习记忆能力。结果见表3。

表3 ZHT对D-半乳糖衰老小鼠学习记忆能力的影响

2.2 ZHT对海马组织形态学变化的影响

HE染色光镜下观察发现，模型组小鼠海马神经细胞失去了有规律的轮廓，尼氏小体减少；神经细胞核变形缩小，排列紊乱、稀疏。给予ZHT后海马神经元排列较整齐，尼氏小体增加，变性神经元增加。结果见图1。

2.3 ZHT对小鼠海马组织匀浆SOD、MDA、GSH-Px活性影响

与正常组比较，模型组小鼠海马组织匀浆SOD、GSH-Px活性显著降低，MDA含量显著升高(P<0.05);与模型组比较，阳性给药组及ZHT各剂量给药组SOD、GSH-Px活性显著升高，MDA含量显著降低(P<0.05)。结果见图2。

图1 ZHT对小鼠海马组织形态学变化的影响(HE,×200)   

图2 各组小鼠组织匀浆中SOD、MDA、GSH-Px含量检测结果

2.4 ZHT对衰老小鼠海马BNDF、TrkB mRNA表达的影响

结果显示，经RT-PCR检测，ZHT给药组海马BNDF、TrkB mRNA表达均明显高于模型组，结果见图3。

图3 ZHT对衰老小鼠海马BNDF、TrkBmRNA表达的影响

3、讨论

随着年龄增长，人们的学习、记忆等认知功能会出现不同程度的减退，对人们的生活及工作影响较大。学界始终对延缓衰老的药物进行着不断探索，结合分子生物学，大量数据均指向了氧化应激反应，认为其对于人类认知功能障碍及加速衰老有较强的影响作用。

小鼠颈背部皮下注射D-半乳糖，可致体内产生大量自由基而损伤组织细胞，伴机体生理机能减退、学习记忆功能降低，因而可用于模拟自然衰老的神经损害特征[16,17]16-17]。课题组通过 Morris水迷宫实验研究证实，给予注射D-半乳糖小鼠，逗留平台象限时间(t3) 占总时间(t总) 的比值减少，穿越平台次数减少，而给予阳性药物茴拉西坦片和ZHT提取物后，出现明显逗留平台象限时间(t3) 占总时间(t总) 的比值增加，穿越平台次数增加的情况，表明给药后能明显改善小鼠的认知能力。

从HE染色结果可明显看出，模型组海马齿状回细胞数目减少，细胞排列稀疏，细胞形态欠完整等改变，说明D-半乳糖致衰老模型构建成功。给予ZHT提取物干预后，海马组织神经元排列较整齐，轮廓较明显，变性的神经元减少，表明ZHT能改善衰老小鼠的海马组织形态。

有研究表明，人体产生自由基与清除自由基的能力是否达到平衡，与人体衰老联系密切[18,19]18-19]。人体衰老后，抗自由基的能力减弱，体内积累大量的自由基，引起系列的氧化应激反应，导致脂质过氧化程度升高，细胞严重受损，从而造成了学习、记忆等认知功能障碍[20,21]20-21]。本次实验证实，ZHT提取物能显著降低海马组织匀浆MDA含量，提高SOD、GSH-Px活性，表明其有可能通过增强衰老小鼠抗氧化酶活性，改善D-半乳糖引起的氧化应激损伤，从而降低脂质过氧化程度，发挥抗氧化作用。鉴于其化学结构具备多个酚羟基的高还原性化学属性，在其抗氧化应激过程中，有可能直接发挥了抗氧化作用，这一假说有待进一步研究。

BDNF通过与其特异性受体TrkB结合，使其磷酸化进而启动细胞内的信号转导，发挥生物学作用[22]22]。本次实验证实，ZHT给药组可上调海马组织中BDNF及TrkB表达，结果进一步表明，其确实能改善衰老小鼠的认知功能，对延缓衰老有积极意义，但其具体作用机制还需深入研究。

综上所述，ZHT可改善衰老小鼠认知功能，可能与其发挥抗氧化作用，提高海马组织内BDNF和TrkB表达水平有关。本次实验成果为今后延缓认知障碍的药物研究，提供了较有利的数据说明，可为人类的抗衰老事业作出贡献。

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基金资助:广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题(Z20180366);

文章来源:覃开羽,张蓓,吴敏等.水杨梅总黄酮改善衰老小鼠认知功能作用机制研究[J].亚太传统医药,2024,20(01):10-15.