下肢深静脉血栓形成（lower extremity deep venous thrombosis,LEDVT）是周围血管常见疾病之一，指深静脉内血流凝结异常，阻塞深静脉管腔而导致静脉回流障碍[1,2]。临床上深静脉血栓形成的主要因素为血流缓慢、静脉壁损伤以及血液的高凝状态，通常患者伴有下肢肿胀疼痛、突发性的呼吸困难或咳血等，如不能及时治疗，血栓将会扩散至肢体深静脉主干，造成患者长期病痛、致残甚至死亡，严重影响患者的生命健康[3,4]。目前，临床主要通过常规溶栓及抗凝等手段治疗LEDVT，但临床效果并不理想，因此，LEDVT的预防和早期诊断是关键[5]。柚皮素广泛存在于枳实、石斛、枳壳等中药中，是天然的黄酮类化合物，为柚皮苷的苷元成分，其不仅具有显著的降血脂、抗炎、抗真菌、抗氧化等药理活性[6,7]，还具有抑制血栓形成和血小板聚集的作用[8,9]，具有较好的开发应用前景。研究[10]发现，炎症因子可介导下肢血管壁内皮细胞损伤所致的深静脉血栓形成和发展。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase,cGAS）/干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes,STING）信号通路是体内介导DNA免疫应答的主要途径，可参与多种疾病的发生发展，包括细菌、病毒感染及炎症疾病等[11]。活化的cGAS/STING通路可磷酸化核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB）抑制剂（inhibitorsκB,IκB），通过泛素化途径降解使NF-κB释放进入细胞核后促进大量的炎症因子分泌而诱导炎症反应的发生[12]。本研究旨在观察柚皮素能否通过调节cGAS/STING信号通路缓解LEDVT，探讨柚皮素的抗血栓形成机制，以期为其临床应用提供参考数据，现将研究结果报道如下。

1、材料与方法

1.1 实验动物

60只SPF级8周龄雄性SD大鼠，体质量200～220 g，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2016-0002。统一饲养于重庆大学附属三峡医院动物实验中心，动物房内保持室温23～25℃，相对湿度50%～60%，光照12 h昼夜交替循环。自由摄食饮水。本动物实验方案已通过重庆大学附属三峡医院伦理委员会批准，院科伦审：AEWC-211302。

1.2 药物、试剂与仪器

柚皮素（分子式：C15H12O5，成都曼斯特生物科技有限公司生产，批号：A0147，纯度>98%），以0.9%的生理盐水溶解，配制成0.5 g/mL的柚皮素母液。STING激动剂2.5己酮可可碱（DMXAA）（深圳欣博盛生物科技有限公司）；白细胞介素1β(IL-1β）、白细胞介素6(IL-6）、肿瘤坏死因子α(TNF-α）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）等酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；cGAS抗体、STING抗体（美国Abcam公司）；BCA测定试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）。C2000-4全自动血凝仪（北京九强生物技术股份有限公司）；F280SZ全自动血液流变仪（济南爱来宝仪器设备有限公司）；SMZ745光学显微镜（深圳市西尼科学仪器有限公司）；S-4160透射电镜（苏州亚凡生物技术有限公司）；SpectraMax i3x多功能酶标仪（奥地利Molecular Devices公司）。

1.3 分组与模型制备

将大鼠随机分为6组，即假手术组，模型组，柚皮素低、中、高剂量组和柚皮素高剂量+DMXAA组，每组各10只。除假手术组外，其他各组构建LEDVT模型。造模方法[13]：造模前各组大鼠均禁食禁水8 h，给予10%乌拉坦0.1 mL/kg腹腔注射麻醉。仰卧位固定大鼠，剃毛消毒，沿腹部中线切一2 cm的小口，分离并暴露左肾静脉以下的下腔静脉分支，直至髂总静脉分叉处。用显微血管夹分别夹闭该段下腔静脉分支两端，保持2 h。透壁可见该段血管颜色变为暗红色，且细针穿刺后无血液流出视为模型制备成功。血栓形成后取下血管夹，关腹消毒，全程无菌操作。假手术组大鼠除不结夹闭血管外其余步骤同其他各组。造模结束后恢复大鼠至活动状态分笼饲养。

1.4 给药

模型制备成功2 h后，根据文献研究[14]用量，柚皮素低、中、高剂量组分别腹腔注射50、100、200 mg/kg的柚皮素生理盐水溶液干预；柚皮素高剂量+激动剂组大鼠腹腔注射200 mg/kg柚皮素，同时经尾静脉注射25 mg/kg STING激动剂2.5己酮可可碱干预[15]；假手术组和模型组大鼠均腹腔注射等量的生理盐水干预。各组大鼠均每日给药1次，共给药14 d。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 血清各指标检测

末次给药2 h后，抽取各组大鼠静脉血3 mL，以3 000 r/min的速度离心（离心半径：13.5 cm)10 min后，收集各组大鼠血清，采用全自动血凝仪检测D-二聚体（D-dimer）、凝血酶时间（TT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT），检测方法严格按照说明书操作。采用ELISA法检测血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA、GSH-Px、SOD水平。

1.5.2 HE染色法检测静脉血栓形成

截取下腔静脉明显血栓处1～2 cm，用生理盐水漂洗3次，后固定于4%多聚甲醛溶液，包埋盒包埋后流水冲洗固定液，不同浓度酒精脱水后置于二甲苯中，将透明的组织用石蜡包埋，用切片机切成厚度为5μm的薄片。用苏木精水溶液染色切片，蒸馏水冲洗后酒精脱水，将切片用伊红染色3 min。中性树脂封片，晾干后将切片置于显微镜下观察。

1.5.3 血栓质量检测

大鼠麻醉后，开腹，分离股静脉并在结扎下方2 cm处夹闭管腔，分离股静脉内皮与血栓。取出血栓组织块，吸除多余水分，用天平称取血栓质量记为湿质量（mg）；后将血栓移至培养皿中，在干燥器中室温干燥24 h，天平称血栓质量记为干质量（mg）。

1.5.4 透射电镜检测静脉血栓组织超微结构

截取下腔静脉明显血栓处1～2 cm，浸入预冷的电镜前固定液中固定24 h，漂洗后固定1.5 h。梯度乙醇脱水后PBS漂洗，将组织于1%锇酸中固定。丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋。超薄切片后，用醋酸铀和枸橼酸铅复染，待切片晾干，透射电镜下观察静脉血栓组织超微结构。

1.5.5 Western Blot法检测静脉血栓组织中cGAS、STING蛋白表达

收集静脉血栓组织，提取总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法检测蛋白浓度，随后加入5×蛋白上样缓冲液煮沸10 min，保存于-20℃的冰箱。取蛋白样品30μg，进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE），再将蛋白样品转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。加入5%脱脂奶粉到PVDF膜上，封闭1 h，分别加入一抗cGAS(1∶1 000）、STING(1∶1 000）以及GAPDH(1∶5 000)4℃孵育过夜。PBS清洗PVDF膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（1∶1 000），室温孵育2 h。加入增强化学发光剂（ECL）进行显影曝光。采用Image Lab软件分析各条带灰度值，目的蛋白相对表达量以目的蛋白灰度值与内参蛋白（GAPDH）灰度值比值表示。

1.6 统计方法

采用Graphpad priam 8.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示。多组比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组大鼠凝血指标比较

图1结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠D-dimer水平升高，TT、APTT和PT时间降低（均P<0.05）；与模型组比较，柚皮素低、中、高剂量组大鼠D-dimer水平降低，TT、APTT和PT时间增加（均P<0.05），且呈剂量依赖性；与柚皮素高剂量组比较，柚皮素高剂量+DMXAA组大鼠D-dimer水平升高，TT、APTT和PT时间降低（均P<0.05）。

2.2 各组大鼠炎症因子水平比较

图2结果显示：模型组大鼠炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于假手术组（P<0.05）；与模型组比较，柚皮素低、中、高剂量组大鼠炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显降低（P<0.05），且呈剂量依赖性；与柚皮素高剂量组比较，柚皮素高剂量+DMXAA组大鼠炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显升高（P<0.05）。

2.3 各组大鼠氧化应激指标比较

图3结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠MDA含量升高，SOD活性和GSH-Px活性降低（均P<0.05）；与模型组比较，柚皮素低、中、高剂量组大鼠MDA含量降低，SOD活性和GSH-Px活性升高（均P<0.05），且呈剂量依赖性；与柚皮素高剂量组比较，柚皮素高剂量+DMXAA组大鼠MDA含量升高，SOD活性和GSH-Px活性降低（均P<0.05）。

2.4 各组大鼠静脉血栓组织病理学表现比较

图4结果显示：假手术组大鼠无血栓形成；与假手术组比较，模型组大鼠股静脉组织中有明显的血栓形成；与模型组比较，柚皮素低、中、高剂量组大鼠股静脉组织中血栓形成随着柚皮素的剂量增加而减少；与柚皮素高剂量组比较，柚皮素高剂量+DMXAA组大鼠股静脉组织中血栓形成明显增加。

图1 各组大鼠凝血指标D-dimer水平及TT、APTT、PT时间比较   

图2 各组大鼠炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较  

(5)P<0.05，与柚皮素高剂量组比较

2.5 各组大鼠血栓质量比较

图5结果显示：假手术组大鼠无血栓形成；与假手术组比较，模型组大鼠血栓湿质量和干质量显著增加（P<0.05）；与模型组比较，柚皮素低、中、高剂量组大鼠血栓湿质量和干质量均显著降低（P<0.05），且呈剂量依赖性；与柚皮素高剂量组比较，柚皮素高剂量+DMXAA组大鼠血栓湿质量和干质量显著增加（P<0.05）。

2.6 各组大鼠静脉血栓组织超微结构比较

图6结果显示：与假手术组比较，模型组静脉组织中有大量血栓形成，且有炎性细胞浸润，可见血小板颗粒特征，基层和表皮层有明显的破坏；与模型组比较，柚皮素低、中、高剂量组血栓形成和炎性细胞明显减少，中层较完好，内皮较连续，官腔内仅有少量的聚集血小板，内皮细胞胞浆较饱满，随着柚皮素浓度的增加改善效果越显著；与柚皮素高剂量组比较，柚皮素高剂量+DMXAA组静脉组织内血栓形成明显增加，破坏程度与模型组相似。

2.7 各组大鼠静脉血栓组织中cGAS、STING蛋白表达比较

图7结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠静脉血栓组织中cGAS、STING蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，柚皮素低、中、高剂量组大鼠静脉血栓组织中cGAS、STING蛋白表达水平均随着剂量的增加呈逐渐递减趋势（P<0.05）；柚皮素高剂量+DMXAA组大鼠静脉血栓组织中cGAS、STING蛋白表达水平明显高于柚皮素高剂量组（P<0.05）。

图4 各组大鼠静脉血栓组织病理学表现比较（HE染色，×400)   

图5 各组大鼠血栓质量比较  

图6 各组大鼠静脉血栓组织超微结构比较（透射电镜，×12 550)  

3、讨论

下肢深静脉血栓形成（LEDVT）发病率呈逐渐上升的趋势，在外周血管疾病中已成为第三大危害人类健康的疾病[16]。LEDVT形成多由于创伤、手术、妊娠及其他长期卧床等因素所致，报道显示约有50%的深静脉血栓患者由于认识不足及延误治疗等演变形成下肢肿胀、色素沉着、溃疡等并发症，严重影响患者的生活和工作[17]。积极控制LEDVT具有重要的研究意义。

血栓形成是临床常见的一种病理性结果，是指血液在流动状态下止血机制被过度激活，血小板功能亢进可介导其形成过程。由此可见，抑制血小板异常聚集及改善血液循环状态，对血栓形成可发挥抑制作用，对血栓溶解可发挥促进作用。因此，本研究构建LEDVT大鼠模型，观察柚皮素抗血栓形成作用。研究[18]发现，采用静脉结扎法构建深静脉血栓动物模型可较好地模拟人体深静脉血栓病理特征，不仅可阻塞血流、损伤静脉内皮细胞及瘀滞血流，同时还具有一定稳定性和可靠性。本研究结果显示：模型组大鼠静脉中有大量的血栓形成，且基层和表皮层有明显的破坏，血栓湿质量和干质量明显增加；不同剂量的柚皮素干预使血栓形成明显减少，且能恢复基层和表皮层，血栓质量明显减轻。提示柚皮素可抑制大鼠LEDVT。

机体的高凝状态及高黏血症等均可介导血栓的形成和发展[19]。目前，临床常用检测凝血功能的指标为APTT、PT、TT、D-dimer。当患者血液存在高凝状态时，凝血功能指标APTT、PT、TT缩短，D-dimer升高，从而促进血栓的形成。有学者[20]认为，炎症反应可介导血栓形成和发展，IL-1β、IL-6和TNF-α是机体炎症反应的早期标志物，通过直接作用于血管内皮细胞导致血管内皮功能障碍，增加机体高凝状态，从而对血栓形成发挥促进作用。还有研究[21]发现，氧化应激反应与血栓的形成密切相关。机体会因抗氧化能力不足、自由基增多等发生氧化应激反应，正常机体中抗氧化物质会通过自由基清除酶（SOD、GSH-Px等）缓解氧化应激状态，减轻血管内皮损伤，维持血管的舒张功能，进而对血栓的形成发挥抑制作用。另外，机体中脂质过氧化物产物MDA含量水平能够较好地反映组织过氧化程度，以间接评价组织氧化应激水平。本研究结果示，模型组大鼠D-dimer,IL-1β、IL-6和TNF-α水平，MDA含量均升高，APTT、PT、TT,SOD活性、GSH-Px活性均减少，提示LEDVT大鼠模型凝血功能异常且血流受阻，存在炎症和氧化应激反应；不同剂量柚皮素干预后，大鼠D-dimer,IL-1β、IL-6和TNF-α水平，MDA含量均降低，APTT、PT、TT,SOD、GSH-Px活性均增加，提示柚皮素可能通过恢复LEDVT大鼠凝血功能，抑制炎症反应、氧化应激，抑制血栓形成。

图7 各组大鼠静脉血栓组织中c GAS、STING蛋白表达比较  

STING是一种定位于内质网的跨膜同行二聚体，在与cGAS催化的第二信使2’3’-cGAMP结合后，通过核转录因子（NF）-κB信号通路触发炎症级联反应和细胞死亡。cGAS/STING信号通路是介导炎症反应及氧化应激反应的重要通路。研究[11]证实，组织损伤、炎症应激反应、病毒感染等均可对细胞质中的cGAS和dsDNA结合进行刺激，通过活化cGAS对SITNG结合胞质中的DNA发挥促进作用，进而形成二聚体调控炎症因子的表达，可介导免疫炎性反应、炎症及非炎症性疾病的发生发展。本研究结果显示，模型组大鼠静脉血栓组织中cGAS、STING蛋白表达增加，不同剂量柚皮素干预后大鼠静脉血栓组织中cGAS、STING蛋白表达减少，提示柚皮素可抑制下肢深静脉血栓大鼠静脉血栓组织中cGAS/STING信号通路的激活，抑制炎症反应，因此推测其可能是柚皮素抑制血栓形成的机制之一。为了验证这一推想，本研究采用cGAS/STING信号通路激动剂2.5己酮可可碱（DMXAA）和高剂量的柚皮素共同干预LEDVT模型大鼠，结果显示柚皮素高剂量+DMXAA组大鼠血栓形成增加，炎症反应和氧化应激水平增强，提示DMXAA可逆转高剂量柚皮素对大鼠下肢深静脉血栓形成的抑制作用。

综上所述，柚皮素可缓解下肢深静脉血栓形成，其作用机制与抑制cGAS/STING信号通路激活，进而抑制炎症反应及氧化应激有关。

参考文献:

[14]臧密密,付雪莲,李格琳.柚皮素基于Th1/Th2轴对妊娠高血压大鼠症状的改善[J].西北药学杂志,2023,38(3):68-73.

[15]张涛,谢红兵,高安举,等.基于环磷酸鸟苷-腺苷合成酶/膜蛋白干扰素基因刺激因子通路探讨奥拉西坦对脑出血大鼠神经功能的影响[J].临床神经病学杂志,2022,35(3):201-207.

基金资助:重庆市科卫联合中医药科技项目(编号:ZY201802109);

文章来源:张玉莲,谢华.柚皮素抑制cGAS-STING通路活化对大鼠下肢深静脉血栓形成的影响[J].广州中医药大学学报,2024,41(01):192-199.