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流苏石斛中3种木脂素类成分的含量测定研究

2024-01-15 89 上传者：管理员

摘要：【目的】建立流苏石斛中3种木脂素类成分的含量测定方法。【方法】应用高效液相色谱-电喷雾-离子肼质谱(HPLCESI-MSn)联用技术以及高效液相色谱(HPLC)保留时间定位结合紫外吸收光谱(UV)比对鉴定流苏石斛中的木脂素类成分。采用Kromasil 100-5 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)，乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，体积流量为0.8 mL·min-1，柱温为35℃，质谱使用ESI离子源，负离子模式下采集数据。HPLC含量测定采用与MS分析相同的色谱柱，流动相甲醇+乙腈(V/V=1∶1)-0.01 mol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱，流速0.8 mL·min-1，柱温40℃，检测波长为215 nm。【结果】从流苏石斛中鉴定出丁香树脂酚双葡萄糖苷、丁香树脂酚单葡萄糖苷、丁香树脂酚，含量测定结果显示丁香树脂酚双葡萄糖苷、丁香树脂酚单葡萄糖苷、丁香树脂酚线性范围分别为0.170 1～3.402 0、0.102 0～2.040 0、0.040 3～0.806 0μg(r≥0.999 5)，平均加样回收率范围在97.71%～101.67%，相对标准偏差(RSD)均小于3.0%。10批样品丁香树脂酚双葡萄糖苷、丁香树脂酚单葡萄糖苷、丁香树脂酚的含量分别为0.777 9～1.385 2、0.073 4～0.196 6、0.029 5～0.188 2 mg·g-1。【结论】本研究方法可为流苏石斛的质量评价提供参考依据。

关键词：
丁香树脂酚
丁香树脂酚单葡萄糖苷
丁香树脂酚双葡萄糖苷
含量测定
流苏石斛
质量评价
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石斛始载于《神农本草经》，具有益胃生津、滋阴清热的功效，用于治疗热病津伤、口干烦渴、胃阴不足，病后虚热不退、阴虚火旺等病症，收载于历版《中国药典》中。多糖、生物碱、联苄、黄酮类成分是石斛主要的质量评价指标[1]。流苏石斛Dendrobium fimbriatumHook.，曾名为马鞭石斛，是药典收载石斛中的一种，2020年版《药典》采用薄层色谱法，以联苄类代表性成分石斛酚为对照品鉴别流苏石斛[1]。但有研究表明，叠鞘石斛以及主流石斛亦含有石斛酚[2,3,4]，导致流苏石斛石斛酚鉴别专属性不是很强，而且石斛酚具有一定的挥发性[5]，除药材与饮片外，以石斛酚难以对含流苏石斛的制剂进行质量评价，因此，选择一类或几类性质比较稳定的成分作为流苏石斛评价指标具有重要的意义。近年来，黄酮类成分在石斛质量评价中得到越来越多的应用。课题组对铁皮、霍山、金钗等多种石斛的黄酮类成分进行系统研究，发现黄酮碳苷及其酰化衍生物、黄酮氧苷在不同种石斛及同种石斛不同产区的样品中具有重要鉴别意义[6,7,8]。流苏石斛的部分黄酮碳苷亦有别于其他石斛[9]。木脂素类成分是石斛中除黄酮类成分外的另外一类重要的次生代谢产物，有神经保护、抗肿瘤、抗氧化等药理活性[10,11]，是石斛的有效成分之一。石斛木脂素类以含有2个C6-C3结构单元为主，其中，丁香树脂酚及其单糖苷与双糖苷等木脂烷类化合物较为多见[12,13,14]。流苏石斛中亦分离鉴定出丁香树脂酚单葡萄糖苷[14]，但是否具有丁香树脂酚及其双糖苷尚不明确，能否作为质量评价指标值得探讨。因此，本研究在前期采用质谱（MS）鉴别了流苏石斛黄酮碳苷[9]基础上，进一步采用MS以及结合色谱峰高效液相色谱（HPLC）保留时间定位与紫外吸收光谱（UV）比对方法，鉴别3种主要木脂素类成分，并建立同时测定其含量的方法，为其质量评价水平的提高提供参考依据，现将研究结果报道如下。

1、材料

1.1 仪器与试剂

赛默飞LCQ Fleet离子阱液质联用仪（美国Thermo Finnigan公司）；HP1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司，二极管阵列检测器）；MS 204S(d=0.1 mg）电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。丁香树脂酚双葡萄糖苷（批号：G081459，纯度≥98%），丁香树脂酚单葡萄糖苷（批号：G82565，纯度≥98%），丁香树脂酚（批号：PS011627，纯度≥98%），均购自武汉恒标实验科技有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merk公司）；水为屈臣氏蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

1.2试药

流苏石斛（编号：LS-1～LS-10，来源于广西），经广州中医药大学第一附属医院黄月纯主任中药师鉴定系流苏石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）的干燥茎，鲜品在60℃条件下减压烘干。

2、方法与结果

2.1 流苏石斛中丁香树脂酚单葡萄糖苷与丁香树脂酚双葡萄糖苷的MS鉴别

2.1.1 质谱条件

毛细管温度（capillary temp):350℃；鞘气流速（sheath gas flow rate):30 L·min-1；辅助气流速（aux gas flow rate):10 L·min-1；电喷雾电压（spray voltage):3.0 kV；毛细管电压：-35 kV；离子化方式：ESI（-）；扫描范围（m/z):150～1 000；碰撞气为氦气；碰撞能量：35%；数据处理系统为仪器自带的Xcalibur软件。

2.1.2 色谱条件

色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6 mm×250 mm,5μm）；流动相为乙腈（A)-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min,A为5%→14%;10～20 min,A为14%→16%;20～45 min,A为16%→22%;45～80 min,A为22%→40%;80～90 min,A为40%→63%）；柱温为35℃；体积流量为0.8 mL·min-1；进样量为5μL；紫外检测器的检测波长为340 nm。

2.1.3 供试品溶液的制备

取石斛粉末（过60目筛）约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 mL,80℃水浴加热回流4 h，取出，放冷至室温，滤过，用甲醇10 mL洗涤容器及滤渣，合并滤液。60℃减压浓缩至近干，加入甲醇10 mL超声溶解，浓缩至适量容积，转移至2 mL容量瓶中。用甲醇适量洗涤，并加入量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 MS鉴定结果与分析

课题组在采用HPLC-ESI-MSn方法对流苏石斛的黄酮类成分进行结构解析时，发现流苏石斛负离子模式总离子流图中化合物1和化合物2为木脂素类成分，见图1。木脂素类化合物在EI-MS谱中，会先脱去葡萄糖，苷元部分主要发生苄基裂解，丢失甲基，甲氧基以及四氢呋喃的裂解等。负离子模式下，化合物1的一级质谱MS1给出准分子离子峰[M-H]-(m/z 741），二级质谱MS2脱去一分子葡萄糖中性碎片得到碎片离子[M-H-162]-(m/z 579），三级质谱MS3以苷元碎片离子[M-H-162-162]-(m/z417）为基峰，四级质谱MS4以C-9’氧醚键及C-7和C-8之间碳碳键的裂解得到的碎片离子m/z 181为基峰，五级质谱MS4丢失甲基得到碎片离子m/z166，结合HPLC图谱中对照品的保留时间和紫外吸收光谱特征定位，推测化合物1为丁香树脂酚-4,4’-二-O-β-D-葡萄糖苷，同理，推测化合物2为丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷，见图2、图3。虽然，在流苏石斛负离子模式总离子流图（0～70 min）中丁香树脂酚未出峰，但可以从液相色谱图中对照品的保留时间和紫外吸收光谱特征推测出来，见图4、图5。

2.2 流苏石斛中丁香树脂酚双葡萄糖苷、丁香树脂酚单葡萄糖苷及丁香树脂酚含量的测定

2.2.1 色谱条件

Kromasil 100-5 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）；流动相为甲醇+乙腈（A,V/V=1∶1)-0.01 mol/L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱（0～20 min,A为14%～18%;20～35 min,A为18%～22%;35～40 min,A为22%～26%;55～65 min,A为30%→36%;65～75 min,A为36%～40%A;75～85 min,A为40%～60%）；检测波长为215 nm；流速0.8 mL/min；柱温40℃；进样量5～20μL；检测波长：215 nm。

2.2.2 样品溶液制备及对照品溶液的制备

2.2.2. 1 对照品溶液制备

取丁香树脂酚双葡萄糖苷、丁香树脂酚单葡萄糖苷、丁香树脂酚适量，精密称定，加60%甲醇分别制成浓度为170.1、102.0、40.3μg·mL-1的对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液2、5、5 mL，分别置于5、10、10 mL容量瓶中，加入60%甲醇至刻度，制得浓度为68.04、51.01、20.15μg·mL-1的对照品溶液。

图1 流苏石斛HPLC-ESI-MSn负离子模式总离子流图

图2 丁香树脂酚双葡萄糖苷负离子2(A）、3(B）、4(C）级质谱图

图3 丁香树脂酚单葡萄糖苷负离子2(A）、3(B）、4(C）级质谱图

图4 流苏石斛中丁香树脂酚双葡萄糖苷、丁香树脂酚单葡萄糖苷及丁香树脂酚专属性HPLC-UV图谱

2.2.2. 2 供试品溶液的制备

取流苏石斛粉末（过4号筛）0.2 g，精密称定，加入80%甲醇50 mL，超声提取1 h，取出，放冷至室温。滤过，用适量甲醇洗涤滤渣，合并滤液，挥干溶剂。残渣加60%甲醇使溶解，至2 mL容量瓶中，加入60%甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3专属性考察

分别取“2.2.2”项下对照品溶液及供试品溶液适量，按拟定色谱条件，对照品溶液分别进样5μL，供试品溶液进样20μL，分别进行测定，结果分离度良好，见图4。

2.2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液1、2、5、10、15、20μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以进样量X（μg）对峰面积Y进行线性回归，结果见表1。

2.2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液（LS-4)20μL，连续进样6次，测定峰面积，结果3种木脂素类成分平均峰面积的RSD均小于2.15%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液（LS-4)20μL，分别在0、3、6、10、18、24 h进样分析，测定峰面积。结果显示，3种木脂素类成分平均峰面积的RSD均小于2.97%，表明供试品溶液24 h内稳定。

图5 流苏石斛中丁香树脂酚双葡萄糖苷（A）、丁香树脂酚单葡萄糖苷（B）及丁香树脂酚（C）紫外光谱图

表1 线性关系考察结果

2.2.7 重复性试验

取同一批样品（LS-4），按“2.2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下测定，测得丁香树脂酚双葡萄糖苷、丁香树脂酚单葡萄糖苷、丁香树脂酚含量RSD分别为1.72%、2.34%、2.77%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 准确度试验

精密称取已知含量药材粉末（LS-4)0.1 g，精密称定，分别精密加入丁香树脂酚双葡萄糖苷对照品溶液（210μg·mL-1）、丁香树脂酚单葡萄糖苷对照品溶液（16.32μg·mL-1）、丁香树脂酚对照品溶液（28.4μg·mL-1）各0.5 mL，按照“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按“2.2.1”色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表2。

2.2.9 样品测定

取不同批次的流苏石斛药材，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”色谱条件下测定，按外标法计算含量，结果见表3。

3、讨论

本研究在课题组前期流苏石斛黄酮类化学成分鉴别[9]的基础上，结合碎片离子信息进行数据分析，鉴别出木脂素类代表性成分丁香树脂酚-4,4’-二-O-β-D-葡萄糖苷和丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷。由于前期MS鉴定是以分析黄酮碳苷为目的，该色谱条件未能将极性比较小的丁香树脂酚苷元鉴别出来。根据植物次生代谢产物合成的特点，参照其他石斛的文献，推断流苏石斛中可能亦含有丁香树脂酚。本研究通过筛选优化色谱条件，保留时间定位与UV结合比对确定流苏石斛中亦含有丁香树脂酚。

本研究根据3种木脂素UV光谱，选择215 nm作为检测波长，色谱峰吸收相对比较大。为了兼顾同分异构体比较多的黄酮碳苷含量测定，本研究优化了三元流动相系统，方法学研究表明，同时测定3种木脂素类成分方法可行。比较了提取方式（超声提取、回流提取），提取溶媒（80%甲醇、90%甲醇、甲醇）和提取时间（0.5、1、1.5 h）对木脂素类成分提取率的影响，最终确定了80%甲醇超声提取1 h的供试品溶液制备方法。

表2 流苏石斛中3种木脂素加样回收率结果

表3 10批流苏石斛中3种木脂素含量测定结果

本研究含量结果显示，同一批次流苏石斛中，丁香树脂酚双葡萄糖苷的含量远高于丁香树脂酚单葡萄糖苷和丁香树脂酚，丁香树脂酚单葡萄糖苷含量略高于丁香树脂酚，不同批次流苏石斛中3种木脂素成分总含量均比较大，但差异不明显，表明流苏石斛中木脂素类成分含量比较稳定，可为流苏石斛的质量评价提供研究依据。目前，其他石斛木脂素含量的文献报道较少，流苏石斛丁香树脂酚双葡萄糖苷含量比较高是否是流苏石斛的一个特点，是否可作为流苏石斛新的质量评价指标还有待于进一步研究。

参考文献:

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文章来源:黄樱华,张林,李锦妍等.流苏石斛中3种木脂素类成分的含量测定研究[J].广州中医药大学学报,2024,41(01):207-212.