远志为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志P.sibirica L.的干燥根，其药用历史悠久，始载于《神农本草经》，列为上品，视为养命之要药，具有安神益智、祛痰消肿等功效，主要用于心肾不交引起的失眠多梦、健忘惊悸、神志恍惚等[1]。现代研究表明，远志中含皂苷、酮、寡糖酯等化学成分，具有改善认知障碍、增强学习记忆、抗衰老等药理作用[2,3]，临床应用广泛。

远志是我国常用大宗药材，但近年来随着临床需求量的增加，其野生资源大量减少。目前，我国的远志主要分布在山西、陕西、河北和山东等地，以山西和陕西为主要产地[4]。但由于生产周期长、产量低、规模小，市场上近缘种、习用品、掺伪现象较多。白薇、瓜子金、三叶香草等经常被用于充当远志药材，严重影响远志药材质量和用药安全[5]。目前对远志的鉴别以传统的性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别等为主，但传统鉴别对鉴定者理论基础和实践经验要求较高，并且受准确性、检测效率、药材形态等因素限制，影响药材鉴定准确性。近年来，DNA分子鉴定、高效液相色谱等技术被逐渐应用到中药的质量控制[6]。本研究拟通过HPLC指纹图谱对来自3个产地的14批远志药材进行指纹图谱研究，并通过DNA分子鉴定技术对14批远志药材及其近缘种白薇、瓜子金等进行rbc L序列的鉴别研究，通过化学成分表征和分子生物学信息相结合，为远志药材的质量控制及质量评价提供依据。

1、材料与仪器

1.1 材料

14批远志药材从陕西、山西采集，保存于湖南省中医药研究院中药创新药物研究所，经刘浩副研究员鉴定14批药材基原植物为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.。14批远志药材产地信息见表1。市售白薇（编号202101，产地为山东）、瓜子金（编号202201，产地为江西）经刘浩副研究员鉴定其基原植物分别为萝藦科植物白薇Cynanchum atratum Bge.和远志科植物瓜子金P.japonica Houtt.。远志对照药材（批号120989-201107）购自中国食品药品检定研究院。远志酮III（批号100298-201203，中国食品药品检定研究院）、3,6′-二芥子酰基蔗糖（批号100298-201203，中国食品药品检定研究院）、西伯利亚远志糖A5（批号107702-201801，宝鸡市金台区盛世科技仪经营部），所有对照品质量分数均大于98%。 

表1 14批远志药材来源信息  

1.2 仪器

高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity II，安捷伦），XPE-105型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），Quintix224-1CN型万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），GY-FS-06型粉碎机（江西赣云食品机械有限公司），Multifuge×1R型冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司），Eppendorf AG 22331 Hamburg型聚合酶链式反应仪（德国艾本德股份公司），Universal Hood II型凝胶成像仪（武汉佰蕾真生物科技有限公司），JY-SPCT型电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）。

2、方法与结果

2.1 HPLC指纹图谱

2.1.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,0.5μm,SN:USCL041482），柱温30℃；检测波长316 nm；进样量10μL；以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B；按表2进行梯度洗脱，预运行10 min，体积流量1.0 m L/min。 

表2 流动相梯度洗脱程序  

2.1.2 供试品溶液制备

精密称取14批远志药材样品粉末（过四号筛）各1.0 g，置50 m L锥形瓶中，精密加入70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）10 m L，称定质量，超声（300 W、40 k Hz)30 min，取出放冷，再称定质量，用70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）补足减失的质量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。精密称取远志对照药材粉末（过四号筛）1.0 g，同法制得远志对照药材溶液。

2.1.3 对照品溶液制备

取对照品西伯利亚远志糖A5、远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖适量，加甲醇溶解，制成各含西伯利亚远志糖A5、远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖约0.2 mg/m L的混合溶液，作为混合对照品溶液。

2.1.4 精密度试验

取编号为202004的远志药材样品，采用“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。标定20个特征峰，以5号峰3,6′-二芥子酰基蔗糖（S）为参照物峰，计算其他特征峰与参照物峰的相对保留时间与相对峰面积。结果20个共有峰的相对保留时间的RSD不超过0.53%，相对峰面积的RSD不超过1.67%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验

取编号为202004的远志药材样品，采用“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。标定20个特征峰，以5号峰为3,6′-二芥子酰基蔗糖（S）为参照物峰，计算其他特征峰与参照物峰的相对保留时间与相对峰面积。结果20个共有峰的相对保留时间的RSD不超过0.53%，相对峰面积的RSD不超过1.45%，表明本方法重复性良好。

2.1.6 稳定性试验

取编号为202004的远志药材样品，采用“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件，分别于0、2、6、9、22、26、33 h进样，记录色谱图。标定20个特征峰，以5号峰为3,6′-二芥子酰基蔗糖（S）为参照物峰，计算其他特征峰与参照物峰的相对保留时间与相对峰面积。结果表明，20个共有峰相对保留时间RSD不超过0.66%，相对峰面积RSD不超过1.68%，证明供试品溶液在33 h内稳定性好。

2.1.7指纹图谱的建立及相似度分析

精密称取14批远志药材样品粉末（过四号筛）各1.0 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。通过与混合对照品溶液比对，指认了3个成分，分别为西伯利亚远志糖A5(1号峰）、远志酮III(3号峰）、3,6′-二芥子酰基蔗糖（5号峰）。将测定获得的14批远志药材HPLC图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，进行多点校正（20个Marker峰）并自动匹配，以中位数法生成对照指纹图谱（R），时间窗宽度为0.1，选择S1为参照图谱，以5号峰（3,6′-二芥子酰基蔗糖）为参照峰（S），标定了20个特征峰。色谱图见图1。

计算其他特征峰与参照物峰的相对保留时间与相对峰面积，计算得到20个共有峰相对保留时间的RSD在1.05%以内，相对峰面积的RSD在18.97%以内，说明不同产地远志药材内含物有一定差异。计算各样品指纹图谱与对照药材及对照指纹图谱（R）的相似度。结果如表3所示，以对照药材计算相似度，14批远志药材相似度为0.918～0.945,RSD为0.989 8%；以对照指纹图谱计算相似度为0.997～0.999,RSD为0.064 7%。

2.1.8 聚类分析

将14批远志样品20个共有峰的峰面积数据导入SPSS 25.0软件进行分析，选择组间连接和平方欧式距离的方法，作聚类分析树状图。由图2可知，当欧式距离为15时，14批远志按产地分为3类，可见不同产地远志化学成分的含量存在一定的差异。

2.1.9 主成分分析（principal component analysis,PCA)

将14批远志指纹图谱的20个共有峰的峰面积导入SIMCA 17软件，建立PCA模型，得到模型解释率参数RX2=0.850，预测能力参数Q2=0.529，表明提取的主成分可解释85.0%的原始变量，模型的预测能力为52.9%。不同产地远志的PCA得分图见图3，可见14批远志样品基本分为3类，与聚类分析结果相互佐证，进一步说明不同产地远志药材化学成分的含量存在一定的差异。

图1 不同产地远志药材(A)、对照指纹图谱(B)和混合对照品图谱(C)    

表3 远志药材相似度评价结果 

图2 14批远志HPLC指纹图谱聚类分析   

图3 不同产地远志PCA得分图   

2.1.1 0 正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)

为进一步寻找导致不同产地远志药材间差异的标志物，采用OPLS-DA模型对14批远志药材样品进行分析。将14批远志指纹图谱的20个共有峰的峰面积导入SIMCA 17软件，建立OPLS-DA模型，模型解释率参数RX2和RY2分别为0.846和0.953，模型预测能力参数Q2为0.881，表明模型对变量X的可解释能力为84.6%，对变量Y的可解释能力为95.3%，模型的预测能力为88.1%，说明该模型稳定、可靠。OPLS-DA模型结果见图4，该结果与聚类分析、PCA结果一致，进一步验证了分析结果的可靠性。

采用统计推断方法分析该模型[7]，对模型进行200次置换检验进行验证，结果如图5所示，检验参数R2=(0,0.324）、Q2=(0，-0.605），所有位于左边的R2和Q2值均低于最右边的值，且Q2点的回归线与垂直轴（左侧）相交于0以下，表明所建立的模型未出现过拟合现象，可用于14批远志药材的判别分析。变量投影重要性（variable importance in projection,VIP）值是筛选差异性化合物的重要指标，VIP值越高，说明其对组间差异的影响越大[8]。提取20个共有峰VIP值，以VIP>1为标准[9,10]，筛选出10个主要峰，见图6，按VIP值大小排序分别为1（西伯利亚远志糖A5）、15、5(3,6′-二芥子酰基蔗糖）、14、4、19、18、3（远志酮III）、17、13号峰。由此可见，这10个峰对应的化学成分可能是导致3个不同产地远志药材产生差异的主要原因。

图4 不同产地远志OPLS-DA得分图   

图5 OPLS-DA模型置换检验图  

2.2 rbc L序列分子鉴定

2.2.1 样品DNA提取

药材用75%乙醇擦拭药材表面，自然晾干，刮去外皮，液氮速冻研磨使成粉末，照高效植物基因组DNA提取试剂盒说明书操作，提取样品基因组DNA。

2.2.2 PCR扩增

PCR反应体系25μL:2×Prime STAR Max Premix 12.5μL，引物：rbc La＿F:5’-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’;rbc La＿R:5’-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3’各0.75μL,DNA模板1μL，灭菌水补足至25μL。扩增程序：95℃、4 min;94℃、30 s,55℃、1 min,72℃、1 min,35个循环；72℃、10 min。制备1%琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物2μL结果见图7，可见各样品扩增条带单一明亮，表明各样品均扩增成功。

图6 不同产地远志OPLS-DA的VIP值图   

图7 rbc L序列PCR产物电泳图   

2.2.3 rbc L测序分析

rbc L序列测序由长沙擎科生物科技公司测序完成。测序结果通过Seqman软件进行序列拼接和人工校正，去除拼接后的序列两端的低质量区。将所得序列通过美国国家生物技术信息中心（NCBI,https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行Blast对比鉴别，取相似性最高的比对结果。比对结果显示，14批远志（编号202001～202014）的rbc L序列一致，与NCBI数据库中物种Polygala tenuifolia Willd（登录号：OK217278.1、NC＿050829.1）的相似性均达到100%。白薇（编号202101）与物种Cynanchum atratum Bge.（登录号：GQ436511.1）的相似性达100%。瓜子金（编号202201）与物种Polygala japonica Houtt.（登录号：MN206278.1）的相似性达100%。

另从Gen Bank数据库下载了远志混淆品的rbc L序列共7条，样品信息见表4，采用MEGA-X软件计算遗传距离，并构建系统发育树。遗传距离结果见表5，远志种内的遗传距离均为0.000，远志与混淆品的遗传距离为0.006 4～0.741 7。采用NJ法构建了系统发育树，结果见图8，远志属共聚为一个大支，其中14批远志样品与NCBI数据库中远志已有序列聚为一支，混淆品各自分支或相互聚为一支。  

表4 样品信息  

表5 遗传距离分析 

3、讨论

3.1 提取工艺的优化

本研究对回流提取与超声提取2种方式进行了考察，结果发现回流提取与超声提取所得的远志药材图谱无差异，考虑到操作的方便性，选择超声提取作为处理方式。对提取溶剂甲醇、水、70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）进行考察，发现70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）样与水样的检测图谱中整体峰形较好、分离效果较好，峰数多，但水样在制备时难滤过，滤液较浑浊，因此选择70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）作为提取溶剂。对提取溶剂70%甲醇（10%氢氧化钠溶液配制）不同用量10、20、30 m L进行考察，发现溶剂用量对远志药材HPLC图谱的峰数、分离效果无明显影响，考虑到溶剂用量高时，响应值较低，不利于峰信号采集，故选择10 m L作为溶剂用量。对提取时间进行考察，发现提取时间20、30、40、50 min对远志药材HPLC图谱的峰数、分离效果无明显影响，为保证样品提取完全，选择30 min作为提取时间。

图8 基于rbc L序列构建的NJ树   

3.2 色谱条件的优化

本研究对不同流动相（乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液）进行了考察，发现当流动相为乙腈-水时后四分之一时间段内的色谱峰基线不平稳，色谱峰分离效果差。乙腈-0.05%磷酸和乙腈-0.1%磷酸2种流动相体系的色谱峰相似，故选择乙腈-0.05%磷酸作为流动相。对检测波长（210、254、316、350 nm）进行了考察，结果发现检测波长为254 nm和350 nm时，后三分之一时间段没有色谱峰。210 nm和316 nm波长下的色谱图相似，但210 nm为紫外末端吸收，背景基线高，流动相在该波长下吸收也很明显；316 nm波长下色谱峰的分离效果更好，故选择316 nm作为检测波长。

3.3 指纹图谱及化学计量学结果分析

为进一步对不同产地远志药材进行质量评价，本研究在最佳色谱条件下对14批不同产地远志药材进行指纹图谱分析，14批远志样品以对照药材图谱和对照指纹图谱计算相似度分别为0.918～0.945和0.997～0.999,RSD分别为0.989 8%和0.064 7%，可以看出，以生成的对照指纹图谱计算相似度结果更好，说明14批远志药材相似度高，但是与对照药材存在一定差异。指纹图谱标定了20个共有峰，指认了3个共有峰化学成分。聚类分析结果为当欧氏距离为15时可将14批远志药材按产地聚为3类，此结果与PCA、OPLS-DA的结果一致，同时通过OPLS-DA的VIP筛选法得到VIP大于1的10个峰，推测这10个峰对应的化学成分可能是导致3个不同产地远志样品产生质量差异的潜在成分，可对不同产地远志药材的质量控制中指标成分的选择提供参考。运用化学模式对远志药材质量进行综合分析，方法简便、准确、重复性好，可为远志药材全面质量评价提供更完善的方法。

3.4 rbc L序列分子鉴定结果分析

在植物药4种DNA条形码通用引物序列中，ITS2序列与psb A-trn H序列用于远志的DNA分子鉴定已有报道[5,11]，目前尚未见文献对远志mat K序列和rbc L序列分子鉴定相关研究。本研究对远志样品mat K序列和rbc L序列进行了PCR扩增，两种序列PCR扩增条带明亮，但后续测序结果发现远志样品mat K序列的测序结果多为双峰，会影响分析结果的准确性，因此最终选择rbc L序列进行后续的研究。本研究成功扩增并测定了14批远志药材rbc L序列，经与NCBI数据库比对，远志各批次样品的rbc L序列与公共数据库中远志科植物远志的基因组序列相似性均达到100%，验证了14批远志基原均为远志科植物远志。通过遗传距离分析，发现14批远志药材种内遗传距离均为0，说明14批远志药材均为同一物种。结合遗传距离和NJ树分析，发现rbc L序列能将远志及其混淆品明显区分开来。因此，rbc L序列可以对远志及其混淆品白薇、瓜子金、西南远志等进行有效鉴定，为该药材的区分鉴定提供了新的技术手段，丰富了NCBI远志序列库。

DNA分子鉴定是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断新技术，具有快速、便捷、通用、对技术人员要求低等优点，是对传统鉴定方法的有效补充，近年来该技术被广泛应用于中药材及其基原植物的鉴定[12,13,14]。HPLC指纹图谱是基于对物质群整体作用的认识，借助于色谱技术获得的中药化学成分的色谱图，是实现鉴别产品真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可靠手段[15,16]。2种鉴别方法分别从分子水平和化学成分水平鉴别，一个侧重微观层面，另一个侧重宏观层面，能更全面地评价药材质量。本研究所建立的指纹图谱方法专属性强，rbc L序列分子鉴定方法准确度高，稳定性好，为有效控制远志药材的质量和远志药材的区分鉴定提供了依据。

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基金资助:湖南省自然科学基金科药联合项目(2021JJ80045);

文章来源:郑玉霄,杨晨,张彬等.远志HPLC指纹图谱及rbcL序列分子鉴定研究[J].中草药,2024,55(02):588-595.