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易混淆中药地骨皮、香加皮、五加皮鉴别研究

2024-01-22 398 上传者：管理员

摘要：目的：探讨区分鉴别易混淆皮类中药地骨皮、香加皮、五加皮的方法。方法：采用性状、微性状、显微、荧光鉴别等方法对地骨皮、香加皮、五加皮进行鉴别研究。结果：地骨皮、香加皮、五加皮在性状和微性状方面的主要鉴别点是外表面、断面和气味；显微鉴别的重点是草酸钙结晶不同。传统荧光法在紫外灯下观察三者的荧光现象区别不明显，但是二维荧光和三维荧光等方面均有较大差异。二维荧光光谱结果显示，三种药材的水提取液均只有一个荧光峰，三者的峰位、峰强度和峰形有很大差别；三维荧光光谱结果显示，地骨皮有三个荧光峰，香加皮和五加皮有两个荧光峰，三者的峰位和峰强度有明显差异。结论：传统鉴别方法可用于地骨皮、香加皮、五加皮的鉴别，二维荧光光谱法和三维荧光光谱法可快速、准确地区分三种药材。

关键词：
三维荧光光谱法
二维荧光光谱法
五加皮
地骨皮
微性状鉴别法
香加皮
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地骨皮为茄科植物枸杞Lycium chinense Mill.或宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥根皮，香加皮为萝藦科植物杠柳Periploca sepium Bge.的干燥根皮，五加皮为五加科植物细柱五加Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith的干燥根皮[1]。地骨皮中富含生物碱类、苯丙素类、有机酸类、黄酮类等成分，具有降血压、降血糖、降血脂、解热止痛、抗菌及免疫调节等作用[2]；香加皮的主要化学成分有强心苷类、C21甾类、萜类等，有强心、抗肿瘤、免疫调节、抗炎等生物活性[3]；五加皮中含有黄酮类、皂苷、生物碱、强心苷、多糖、维生素等成分，具有抗疲劳、抗肿瘤、抗炎、提高免疫、抗衰老等药理作用[4]。地骨皮、香加皮、五加皮的药用部位均为根皮，三者性状非常相似，在临床使用中很容易混淆，且香加皮有毒性，若临床应用不当，可能直接威胁患者生命安全，造成不可挽回的损失[5]。另外，由于五加皮的市场需求量较大，野生品和栽培品的产量远远不够，各种替代品、混伪品层出不穷。虽然针对这三种药材的鉴别早已有报道，但针对当前市场上红毛五加、刺五加、香加皮、地骨皮常以伪品药材冒充五加皮出售的现象[6]，还应加强对这三种药材的鉴别研究。

目前，对于地骨皮、香加皮、五加皮的鉴别，应用最多的是性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱和紫外灯下观察荧光等传统鉴别方法[7,8,9,10]，虽然也有相关研究报道，但大多为文字资料，缺乏全面、系统的影像资料。本研究运用性状鉴别法、微性状鉴别法、显微鉴别法和荧光光谱法，对易混淆中药地骨皮、香加皮、五加皮进行综合对比鉴别，并补充完善了其微性状、显微、荧光光谱等影像资料，以防止其混用，确保用药安全，以期为地骨皮、香加皮、五加皮的快速鉴别提供新的思路和参考。

1、材料与仪器

1.1 试药

地骨皮、香加皮、五加皮均购自山东百味堂中药饮片有限公司，批号依次为20210911、20220316、20220328，经山东中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为正品。

1.2 试剂

实验室自制蒸馏水，水合氯醛（分析纯，批号Q/12HB 4218-2017，天津市科密欧化学试剂有限公司），甲醇（分析纯，批号20221108，天津市富宇精细化工有限公司）。

1.3 仪器

DM500生物数码显微镜（济南德胜光电仪器有限公司），SZM-45T体视显微镜（济南德胜光电仪器有限公司），FW177高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司），WFH-203C四用紫外分析仪（上海驰唐实业有限公司），TDL-5-A低速离心机（上海安亭科学仪器厂），佳能EOS 70D相机[佳能（中国）有限公司]，FA2004B电子天平[天美（中国）科学仪器有限公司]，KQ-500DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），F-7000荧光分光光度计（日本日立公司）。

2、方法与结果

2.1 性状及微性状鉴别

2.1.1 性状鉴别

分别取适量地骨皮、香加皮、五加皮置于白纸上，对其形状、外表面、内表面、断面等进行观察，用相机拍摄，获取照片。结果见图1、表1。

2.1.2 微性状鉴别

微性状鉴别法是借助仪器观察中药材表面（包括断面）肉眼不易观察到的细微性状特征[11]，可以为传统的性状鉴别作出补充。本研究借助体视镜分别观察地骨皮、香加皮、五加皮的外表面、内表面及断面，并拍摄照片。结果见图2、图3、图4、表2。

2.2 显微鉴别

分别取干燥的地骨皮、香加皮、五加皮药材，粉碎，过60目筛，取少许药材粉末置于洁净的载玻片上，滴加2～3滴水合氯醛，用解剖针轻轻搅拌均匀，将载玻片置于酒精灯上方加热透化2～3次，放冷，轻轻盖上盖玻片。并制作三种药材的水装片，观察淀粉粒。制好的临时装片置于显微镜下观察，拍照。结果见图5、图6、图7、表3。

图1 地骨皮、香加皮、五加皮的性状特征图

表1 地骨皮、香加皮、五加皮性状鉴别比较

图2 地骨皮微性状特征图

图3 香加皮微性状特征图

2.3 荧光鉴别

2.3.1 紫外灯下荧光观察

2.3.1. 1 药材断面荧光

分别将三种药材饮片断面置于紫外灯（365 nm）下观察荧光颜色，拍照并记录。结果见图8。

2.3.1. 2 药材粉末荧光

分别将三种药材粉末置于紫外灯（365 nm）下观察荧光颜色，拍照并记录。结果见图9。

2.3.1. 3 药材浸出液荧光

称取地骨皮、香加皮、五加皮粉末各1 g，分别置于3个25 m L锥形瓶中，加入甲醇10 m L，浸渍2 h后，离心10 min，转速3 000 r/min，离心半径为16 cm，取上清液滴至滤纸上，置于紫外灯（365 nm）下观察荧光颜色，拍照并记录。结果见图10。

2.3.2 二维荧光光谱法

2.3.2. 1 样品制备

精密称取地骨皮、香加皮、五加皮粉末各0.2 g，分别置于3个具塞锥形瓶，分别加入纯净水20 m L，称重，超声提取30 min，称重，补足失重，离心10 min，转速3 000 r/min，离心半径为16 cm，离心结束后各取上清液1 m L，于3个10 m L的容量瓶中，分别加水定容至刻度，制得质量浓度为1 mg/m L的供试品溶液，置荧光分光光度计下检测其光谱。

图4 五加皮微性状特征图

表2 五加皮、香加皮、地骨皮微性状鉴别比较

图5 地骨皮显微特征图

图6 香加皮显微特征图

图7 五加皮显微特征图

表3 地骨皮、香加皮、五加皮粉末显微鉴别比较

2.3.2. 2 二维荧光光谱条件

激发波长（Ex):254 nm；入射狭缝和出射狭缝：5 nm；扫描速度：1 200 nm/min；扫描范围：200～700 nm；电压：400 V；响应时间：0.1 s。

2.3.2. 3 结果分析

254 nm和508 nm左右的峰分别为瑞利散射峰和二倍瑞利散射峰，地骨皮、香加皮、五加皮水提取液均只有一个荧光峰，但三者的峰位、峰强度和峰形有很大差别，地骨皮在348.4 nm处有荧光强度较大的峰，香加皮和五加皮的荧光峰位都在400.0 nm左右，二者的荧光强度和峰形相差很大，香加皮的荧光强度较大，五加皮的荧光强度很小，且峰形很平缓。三者的二维荧光光谱有明显差异，运用二维荧光光谱法可以很好地将三者区分鉴别开来。见图11、表4。

2.3.3 三维荧光光谱法

2.3.3. 1 样品制备

同2.3.2.1。

2.3.3. 2 三维荧光光谱条件

Ex:200～700 nm；发射波长（Em):200～700 nm；狭缝宽度：5 nm；电压：400 V；扫描速度：60 000 nm/min；采样间隔：10 nm。

图8 地骨皮、香加皮、五加皮断面荧光图

图9 地骨皮、香加皮、五加皮粉末荧光图

图1 0 地骨皮、香加皮、五加皮甲醇浸出液荧光图

2.3.3. 3 结果分析

地骨皮在Ex=280、Em=330处有一个等高线密集的强荧光峰，在Ex=230、Em=330和Ex=340、Em=440处有两个较弱的荧光峰；香加皮在Ex=250、Em=390处有一个较弱的荧光峰，在Ex=360、Em=450处有一个相对较强的荧光峰；五加皮在Ex=230、Em=420和Ex=310、Em=430处有两个等高线疏松的弱荧光峰。三者的三维荧光光谱的荧光峰位置和强度有明显差别，三维荧光光谱法可应用于三者的鉴别。见图12、表5。

3、讨论

李峰等[12,13]研究指出，用荧光法鉴别中药材时，多采用254 nm和365 nm的紫外光，本实验分别考察了254 nm和365 nm波长下的荧光现象，发现三种药材在365 nm波长的紫外灯下荧光现象明显，而在254 nm波长下无荧光，因此本研究选择在365 nm波长的紫外灯下观察并拍照记录地骨皮、香加皮、五加皮的断面、粉末及甲醇浸出液的荧光。紫外灯下观察三种药材的荧光颜色均为蓝色，只有细微的差异，不易区分鉴别。二维荧光光谱结果显示，三种药材的水提取液均只有一个荧光峰，三者的峰位、峰强度和峰形有很大差别，二维荧光光谱法可用于三者的鉴别。三维荧光光谱结果显示，地骨皮有三个峰，香加皮和五加皮有两个峰，三者的峰位和峰强度有明显差异。传统荧光鉴别中断面、粉末、水浸液颜色的差异与荧光光谱鉴别中荧光强度的差异，都一定程度上反映了三者荧光组分含量的差异。运用三维荧光光谱法可以快速、准确地将三者鉴别开来。

图1 1 地骨皮、香加皮、五加皮二维荧光光谱图

表4 地骨皮、香加皮、五加皮的荧光峰和相对荧光强度

图1 2 地骨皮、香加皮、五加皮三维荧光光谱图

表5 地骨皮、香加皮、五加皮的荧光峰和荧光强度

地骨皮、香加皮和五加皮三种药材的化学成分和药理作用各不相同，都具有很好的药用价值，都是临床常用药材，三者的药用部位都是根皮，性状极其相似，临床应用时极易混淆，且香加皮有毒，若应用不当可能会威胁患者的生命安全，因此，亟需快速、准确、客观的方法来鉴别三者。研究表明，传统鉴别方法应用于易混淆中药鉴别的准确度、满意度等均不太理想[14]。微性状鉴别法是借助仪器观察中药材表面（包括断面）肉眼不易观察到的细微性状特征[11]，可以为传统的性状鉴别作出补充，极大地提高了中药性状鉴别的准确性和可靠性，具有快速、简便的优点[15]。王亚军[16]研究发现，微性状鉴别法鉴别中药材准确度和满意度均明显高于传统鉴别法。性状鉴别、微性状鉴别及显微鉴别等传统中药鉴别方法可用于三种药材的鉴别，但对操作人员的专业知识要求较高，非专业人员较难鉴别。传统荧光鉴别虽对操作人员无专业性要求，但对荧光颜色和荧光强度缺乏规范的判定标准，是用人眼观察，主观因素较大，一些荧光现象很弱的药材肉眼较难观察，而荧光光谱法是以二维或三维荧光光谱代替人眼观察到的荧光现象，检测结果数据化，消除了中药传统荧光鉴别方法的主观误差，提高了中药鉴别的客观性和准确性[17,18]。尤其是三维荧光光谱法，可以从整体角度对中药发荧光组分信息进行表征[19]，其建立分别以Ex、Em和荧光强度为X、Y、Z轴作图，通过Ex和Em的同步改变反映荧光强度的变化，操作简便，可达到快速鉴别的目的，目前已应用于中药鉴别、中药质量控制、药物成分分析等多个领域[20,21,22,23]，正逐渐发展成为一种新的中药指纹图谱。此外，三维荧光光谱能为蛋白质构象变化提供更多的详细信息，为有机分子与生物大分子相互作用研究提供了有力的手段[24,25]。三维荧光光谱法在中药质量控制方面的应用还有待进一步开发和研究。

参考文献:

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基金资助:国家科技重大专项(编号:2017ZX09301058);山东省医药卫生科技发展计划项目(编号:202013030996);山东省高校中药质量控制与全产业链建设协同创新中心项目(编号:CYLXTCX2021-08);2022年全国名老中医药专家传承工作室建设项目(批文号:国中医药人教函[2022]75号);

文章来源:秦露,吕绪桢,刘亚丽等.易混淆中药地骨皮､香加皮､五加皮鉴别研究[J].山东中医药大学学报,2024,48(01):91-99.