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蒙药苏格木勒-3汤对大鼠酒精性心肌病的保护作用及机制

2024-02-19 101 上传者：管理员

摘要：目的采用UPLC-PDA法测定消旋山莨菪碱片中的有关物质。方法采用C18柱，以0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(含0.15%三乙胺溶液，磷酸调pH6.5)-甲醇(70:30)为流动相，流速0.2 mL·min-1,检测波长220 nm。结果消旋山莨菪碱、托品酸、阿托酸6β-羟基-3α-托品酯(杂质Ⅰ)的线性回归方程分别为：Y消旋山莨菪碱=2.1391×104X+1.4348×103、Y托品酸=6.9081×104X+5.2007×104、Y杂质Ⅰ=4.8162×104X-6.6659×104,5.304～106.080μg·mL-1消旋山莨菪碱、5.215～52.150μg·mL-1托品酸、5.300～53.000μg·mL-1杂质Ⅰ与峰面积呈良好的线性关系，r分别为0.9998、0.9993、0.9993(n=6)。托品酸、杂质Ⅰ的平均回收率分别为97.21%、100.24%,RSD分别为1.78%、0.67%。结论所用方法准确度高、专属性强、重复性好，可用于测定消旋山莨菪碱片中的有关物质。

关键词：
异构体
托品酸
有关物质
消旋山莨菪碱
消旋山莨菪碱片
生物碱
解痉药物
超高效液相色谱法
阿托酸6β-羟基-3α-托品酯
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山莨菪碱是从茄科植物唐古特山莨菪根中提取得到的一种生物碱，天然品为氢溴酸山莨菪碱，人工合成品称为消旋山莨菪碱。消旋山莨菪碱片临床用于解除平滑肌痉挛、胃肠绞痛、胆道痉挛及有机磷中毒等[1]。该药为中国特有品种，收载于2020年版《中国药典》中。消旋山莨菪碱原料药标准中只对总杂进行了控制，限度为不得大于1.5%;而片剂中却未对有关物质进行控制。消旋山莨菪碱中的杂质主要有药典中规定的杂质Ⅰ、托品酸和6β-羟基托品(醇)[2]。杂质Ⅰ为合成过程中脱水生成的副产物，托品酸和6β-羟基托品(醇)为水解后的降解产物。6β-羟基托品(醇)因无紫外吸收，在同等色谱条件下不出峰。HPLC-PDA法测定消旋山莨菪碱片有关物质时的分析时间偏长，柱效下降较快，分析效率低，不利于样品大批量测定。现建立了UPLC-PDA法测定消旋山莨菪碱片中的有关物质，方法准确、简便、快速、高效，可更好地控制其质量。

1、实验部分

1.1 仪器与试药

K11SM4277A型高效液相色谱仪(美国Waters)。17批消旋山莨菪碱片(2022年全国评价性抽检国内5个生产厂家的样品，规格：5、10 mg);消旋山莨菪碱、阿托酸6β-羟基-3α-托品酯(杂质Ⅰ)、托品酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为：100249-201904、101385-201501、101135-201402;含量分别为：99.7%、100%、100%);甲醇为色谱纯；水为纯化水；其余试剂为分析纯。

1.2 方法与结果

1.2.1 溶液的制备

精密称取10 mg杂质Ⅰ、10 mg托品酸和15 mg消旋山莨菪碱的对照品，分别置10 mL量瓶中，用0.01 mol·L-1盐酸溶解并定容，制成约含1 mg·mL-1杂质Ⅰ和托品酸及1.5 mg·mL-1消旋山莨菪碱的贮备液；分别精密量取0.5 mL杂质Ⅰ、托品酸和1 mL消旋山莨菪碱的贮备液，置10 mL量瓶中，用0.01 mol·L-1盐酸定容，制成含50 μg·mL-1杂质Ⅰ和托品酸及150 μg·mL-1消旋山莨菪碱的溶液，作为系统适用性溶液。精密称取适量样品细粉(约相当于15 mg消旋山莨菪碱),置10 mL量瓶中，加适量0.01 mol·L-1盐酸，超声5 min, 用0.01 mol·L-1盐酸定容，制成约含1.5 mg·mL-1消旋山莨菪碱的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取1 mL供试品溶液，置100 mL量瓶中，用0.01 mol·L-1盐酸定容，作为对照溶液。按消旋山莨菪碱片处方制成空白辅料样品，再按供试品溶液制备方法制备空白辅料溶液。

1.2.2 色谱条件与系统适用性的试验

采用Syncronis C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm),以0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(含0.15%三乙胺溶液，磷酸调pH6.5)-甲醇(70:30)为流动相，检测波长为220 nm, 流速0.2 mL·min-1,柱温30 ℃,进样量5 μL。取系统适用性溶液、空白辅料溶液各5 μL,按上述色谱条件，进样测定，记录时间为主峰保留时间的2.5倍，理论板数按消旋山莨菪碱峰计算大于2×103,消旋山莨菪碱中两异构体色谱峰与其他杂质的分离度均大于1.5,符合规定，空白辅料溶液不干扰检测(图1)。

图1 消旋山莨菪碱系统适用性(A)和空白辅料(B)溶液的色谱图

1.2.3 专属性的试验

精密称取适量样品细粉(约相当于15 mg消旋山莨菪碱),共4份，分别置10 mL量瓶中。两份分别加入3 mL 1 mol·L-1盐酸(用1 mol·L-1氢氧化钠调至中性)和3 mL 3%过氧化氢，于80 ℃水浴中加热1 h, 加0.01 mol·L-1盐酸溶解并定容；另2份分别置100 ℃水浴中加热破坏2 h和置4500±500 Lx光照下放置2 h后，加0.01 mol·L-1盐酸溶解定容。4份经破坏的样品溶液滤过后，取5 μL续滤液进样，记录色谱图。在光照条件下，消旋山莨菪碱较稳定；在高温、强酸和氧化条件下，托品酸的含量稍有增加；4种条件对杂质Ⅰ并无太大影响。各杂质与主峰间的分离度均良好，能够实现有效分离，托品酸为主要降解杂质(图2)。

1.2.4 线性范围、检测限和定量限的考察

精密称取约10 mg杂质Ⅰ、托品酸、消旋山莨菪碱对照品，分别置10 mL量瓶中，用0.01 mol·L-1盐酸溶解并定容，得对应的贮备液；再分别量取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL杂质Ⅰ和托品酸贮备液，0.05、0.2、0.5、0.6、0.8、1.0 mL消旋山莨菪碱贮备液，分别置于6个10 mL量瓶中，用0.01 mol·L-1盐酸制成5、10、20、30、40、50 μg·mL-1杂质Ⅰ、托品酸及5、20、50、60、80、100 μg·mL-1消旋山莨菪碱的系列线性溶液，进样测定，记录色谱图。以顺反异构体峰面积之和及浓度作线性回归，得消旋山莨菪碱及各杂质的线性方程，并通过斜率计算得出2个杂质的校正因子(表1),消旋山莨菪碱及各杂质在各自的范围内线性关系良好。取上述各对照品最低浓度的线性溶液，用0.01 mol·L-1盐酸逐级稀释，取5 μL进样，记录色谱图。按信噪比(S/N)=10计算定量限，按S/N=3计算检测限(表1)。

图2 消旋山莨菪碱未破坏(A)、强酸破坏(B)、氧化破坏(C)、高温破坏(D)、光照破坏(E)溶液的色谱图

表1 消旋山莨菪碱及各杂质的线性关系、检测限及定量限(μg·mL-1)

1.2.5 加样回收率的试验

精密称取适量已知杂质含量的消旋山莨菪碱片粉末(约15 mg消旋山莨菪碱),置10 mL量瓶中，共9份，分别精密加入1.043 mg·mL-1托品酸对照品贮备液(0.04、0.05、0.06 mL)和1.06 mg·mL-1杂质Ⅰ对照品贮备液(0.16、0.20、0.24 mL),用0.01 mol·L-1盐酸定容，制成80%、100%、120%浓度的低、中、高浓度的样品溶液，分别进样测定，计算回收率，托品酸、杂质Ⅰ的平均回收率分别为97.21%、100.24%,RSD分别为1.78%、0.67%,表明方法较准确(表2)。

1.2.6 有关物质的测定

取17批样品和对照品，分别按“1.2.1”项方法制备供试品和对照溶液，分别进样测定，记录色谱图，以加校正因子的自身对照法计算杂质的含量(表3)。

1.2.7 样品的含量测定

精密称取适量样品粉末(约相当于10 mg消旋山莨菪碱),置50 mL量瓶中，加0.01 mol·L-1盐酸溶解并定容，滤过，参照有关物质测定方法，按“1.2.2”项色谱条件，进样测定，记录色谱图；另取消旋山莨菪碱对照品，同法测定，按外标法以顺、反式异构体两色谱峰面积之和计算17批样品的含量(表4)。

表2 加样回收率试验的结果(μg, n=9)

表3 消旋山莨菪碱片中有关物质的测定结果

表4 消旋山莨菪碱片含量的测定结果

1.2.8 精密度、稳定性与重复性的试验

精密吸取系统适用性溶液，按“1.2.2”项色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。计算得消旋山莨菪碱、杂质Ⅰ、托品酸峰面积的RSD分别为0.76%、0.94%、0.84%(n=6),表明仪器的精密度良好。取适量供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h时，按“1.2.2”项下色谱条件，进样测定，记录峰面积。计算得托品酸、杂质I峰面积的RSD分别为1.08%、0.97%,表明溶液在室温下放置24 h内基本稳定。取同厂家同批号的消旋山莨菪碱片，由同一个分析人员在相同条件下平行称量6份样品，按“1.2.1”项方法制备供试品溶液和对照溶液，再按“1.2.2”项色谱条件，进样分析，以自身对照法计算含量。计算得托品酸、杂质Ⅰ含量的RSD分别为2.16%、1.34%(n=6),表明方法的重复性良好。

2、讨论

曾考察了流动相[0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(含0.15%三乙胺溶液，用磷酸调pH6.5)-甲醇、0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-甲醇、0.02%三乙胺溶液-甲醇等系统]、流速(0.1、0.2、0.3 mL·min-1)、流动相初始比例(75:25、70:30、65:25)的影响，结果文中条件满足测定要求。消旋山莨菪碱221.7 nm处、托品酸219.3 nm处、杂质Ⅰ 221.5 nm处有最大吸收，综合考虑，用220 nm作为测定波长。

参考2020年版《中国药典》二部中盐酸消旋山莨菪碱注射液中有关物质的限度要求及结合实际检测结果，拟定样品限度为：供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积(杂质Ⅰ峰乘以校正因子0.44计，托品酸峰乘以校正因子0.31计)不得大于对照溶液中消旋山莨菪碱顺、反式异构体两峰面积之和的1.5倍(1.5%),各杂质峰面积的和(杂质Ⅰ峰乘以校正因子0.44计，托品酸峰乘以校正因子0.31计)不得大于对照溶液中消旋山莨菪碱顺、反式异构体两峰面积之和的2.5倍(2.5%)。17批样品中，有1批样品的托品酸、8批样品的杂质Ⅰ及7批样品的总杂含量超出了限度。托品酸的含量与样品储存期呈正相关，其对照品的典型图谱与样品中的托品酸图谱重合，峰型良好，未见异构体[3]。查阅5家企业的说明书，知其有效期并不统一，有24个月、36个月和48个月，这也可能是各企业样品中杂质存在较大差异的原因之一。

参考文献:

[1]张景媛,吴嘉瑞,周唯,等.山莨菪碱临床应用进展[J].中国医院用药评价与分析,2019,19(4):385-388,392.

[2]王雄飞,孙毅坤,钟苗,等.消旋山莨菪碱的杂质研究[J].药物评价研究,2018,41(2):243-246.

[3]陈青,李军,谭会洁,等.盐酸消旋山莨菪碱注射液有关物质的研究[J].药物分析杂志,2014,34(5):865-868.

文章来源:吴俊峰,张敏娟,彭双等.UPLC测定消旋山莨菪碱片中的有关物质[J].华西药学杂志,2024,39(01):80-83.