参仙升脉口服液是由红参、淫羊藿、补骨脂（盐炙）、枸杞子、麻黄、细辛、丹参和水蛭8味药材制成的中药复方制剂[1]，具有温补心肾、活血化瘀的功效，临床上用于治疗缓慢性心律失常[2]，为国家三类新药。参仙升脉口服液组方药材种类相对较多，化学成分复杂，完善健全的质量评价体系对其质量控制非常重要。已有研究者[3]建立了参仙升脉口服液的HPLC指纹图谱，但其特征峰数目较少，仅标定了3个成分，也未见有更多指标成分含量测定的相关研究报道，不能全面充分地反映参仙升脉口服液的整体质量。中药指纹图谱能够表达中药完整物质信息，表征化学成分的整体特性，是定性鉴别中药材及其制剂真伪、优劣、质量一致性与稳定性的经典有效方法[4,5,6]。中药指纹图谱结合多指标成分定量，应用于中药的质量控制，可以实现定性和定量双重评价[7,8]，使中药质量的稳定性得以保障，安全可控地应用于临床。本研究采用HPLC法建立参仙升脉口服液的指纹图谱，并同时对其中10种指标成分进行含量测定，为其全面系统的质量控制提供科学依据。

1、材料

1.1 主要仪器

Agilent 1260高效液相色谱系统（Agilent公司）；XM-P22H型无级调功超声波清洗机（昆山小美超声仪器有限公司）；BT25S型和BS210S型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 药物与试剂

10批参仙升脉口服液，编号依次为S1～S10，批号分别为160210、181201、181202、191001、210401、210402、210403、211002、220202、220203，由陕西步长制药有限公司提供。对照品盐酸伪麻黄碱（批号171237-201510，质量分数为99.8%）、丹酚酸B（批号111562-201212，质量分数为95.4%）、朝藿定C（批号111780-201905，质量分数为94.3%）、阿魏酸（批号1100773-201018，质量分数≥98%）、补骨脂素（批号110739-200310，质量分数为99.6%）、异补骨脂素（批号0738-200108，质量分数为99.5%）、人参皂苷Rg1（批号110703-201530，质量分数≥98%）和淫羊藿苷（批号110737-200312，质量分数≥98%）购自中国食品药品检定研究院；丹参素（批号H09N10S102463，质量分数≥98%）和迷迭香酸（批号Y06A9K67402，质量分数≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；补骨脂苷（批号CHB-B-163，质量分数≥98%）和异补骨脂苷（批号CHB-Y-280，质量分数≥98%）购自成都克洛玛生物科技有限公司。乙腈为色谱级（美国Thermo Fisher Scientific公司），水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Ultimate LP-C18(250 mm×4.6 mm,5µm），流动相为乙腈（A)-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～15 min,5%A;15～25 min,5%～15%A;25～40 min,15%～18%A;40～45 min,18%～22%A;45～95 min,22%～25%A;95～100 min,25%～5%A），检测波长为270 nm(0～16 min,24～38 min）、210 nm(16～24 min,38～100 min），体积流量为1.0 m L·min-1，柱温为30℃，进样量为10µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液

精密称取丹参素、盐酸伪麻黄碱、补骨脂苷、异补骨脂苷、阿魏酸、迷迭香酸、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、补骨脂素、异补骨脂素、朝藿定C和淫羊藿苷对照品适量，分别置于10 m L量瓶中，加甲醇溶解并定容，作为各对照品的储备液；分别精密吸取各对照品储备液适量，涡旋混匀，制成质量浓度分别为206.51、50.00、374.42、355.81、29.77、35.58、168.84、76.74、36.74、33.72、26.98、69.77μg·m L-1的混合对照品溶液（I），供指纹图谱用。

再分别精密吸取丹参素、盐酸伪麻黄碱、补骨脂苷、异补骨脂苷、迷迭香酸、丹酚酸B、补骨脂素、异补骨脂素、朝藿定C和淫羊藿苷对照品储备液适量，涡旋混匀，制成质量浓度分别为246.67、71.67、429.33、408.00、20.40、110.00、52.67、48.33、38.67、80.00μg·m L-1的混合对照品溶液（Ⅱ），供多指标含量测定用。

2.2.2 供试品溶液

精密吸取一定量的参仙升脉口服液，加16倍体积的甲醇溶解稀释，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 HPLC指纹图谱的建立

2.3.1 精密度试验

取同一份供试品溶液（S10),按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。以补骨脂苷（9号峰）为参照峰，分别计算各共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.36%，相对峰面积的RSD为0.05%～2.67%，表明仪器精密度良好。

2.3.2稳定性试验

取同一份供试品溶液（S10），按“2.1”项下色谱条件，分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h时进行测定，以补骨脂苷（9号峰）为参照峰，分别计算各共有峰的相对保留时间的RSD为0.02%～0.48%，相对峰面积的RSD为0.07%～2.84%，表明供试品在室温放置24 h内稳定。

2.3.3 重复性试验

取同一批次参仙升脉口服液（S10），利用“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，以补骨脂苷（9号峰）为参照峰，分别计算各共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.27%，相对峰面积的RSD为0.06%～2.88%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立及相似度分析

按“2.1”项下色谱条件，对10批参仙升脉口服液供试品溶液进样分析，将数据文件转换成“AIA”格式，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”。以S10为参照图谱，时间窗宽度设为0.3，进行多点校正和Mark峰匹配，共确定28个共有峰；中位数法生成对照指纹图谱，10批参仙升脉口服液的HPLC指纹图谱叠加图和对照图谱（R）见图1(A）。结果计算得10批样品与对照指纹图谱的相似度分别为0.934、0.986、0.994、0.999、0.987、0.991、0.994、0.940、0.995、0.991，均大于0.93，说明不同批次的参仙升脉口服液质量具有较好的一致性。

2.3.5 共有峰的指认

分别取混合对照品溶液（I）和供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样测定，记录色谱图。结果如图1所示，通过各色谱峰保留时间信息，指认出12个色谱峰，分别为2号峰丹参素、5号峰盐酸伪麻黄碱、9号峰补骨脂苷、10号峰异补骨脂苷、11号峰阿魏酸、17号峰迷迭香酸、20号峰人参皂苷Rg1、21号峰丹酚酸B、24号峰补骨脂素、25号峰异补骨脂素、27号峰朝藿定C,28号峰淫羊藿苷。其中9号峰补骨脂苷分离度好，保留时间稳定，峰面积较大，故选作参考峰。

图1 10批参仙升脉口服液HPLC指纹图谱（A）和混合对照品I(B)HPLC图  

2.4 多指标成分定量分析

2.4.1 专属性试验

分别取空白甲醇对照溶液、混合对照品溶液（Ⅱ）和供试品溶液（S10），按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果如图2所示，空白对照溶液在与混合对照品溶液相同保留时间位置上无色谱峰，表明对待测各成分无干扰，方法专属性良好。

2.4.2 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液（Ⅱ），用甲醇逐级稀释至6个不同适宜的浓度，即得系列混合对照品溶液。在“2.1”项下色谱条件进样分析，测定各色谱峰面积。分别以指标成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），构建标准曲线，并计算回归方程与相关系数，10个指标成分的线性关系见表1。

2.4.3 精密度试验

取同一混合对照品溶液，在“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算得丹参素、盐酸伪麻黄碱、补骨脂苷、异补骨脂苷、迷迭香酸、丹酚酸B、补骨脂素、异补骨脂素、朝藿定C和淫羊藿苷峰面积的RSD分别为1.95%、0.82%、1.80%、1.80%、1.82%、1.68%、1.89%、1.84%、1.42%和1.75%，表明仪器精密度良好。  

表1 10个成分的线性回归分析  

图2 空白对照（A）、混合对照品Ⅱ（B）和供试品（C)HPLC色谱图   

2.4.4 稳定性试验

取同一份供试品溶液（S10），按“2.1”项下色谱条件，分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h时，进样测定峰面积，计算得丹参素、盐酸伪麻黄碱、补骨脂苷、异补骨脂苷、迷迭香酸、丹酚酸B、补骨脂素、异补骨脂素、朝藿定C和淫羊藿苷峰面积的RSD分别为1.98%、1.31%、1.88%、1.83%、1.73%、0.86%、2.48%、2.69%、1.70%和1.82%，表明供试品在室温放置24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验

取同一批参仙升脉口服液（S10），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进样分析，计算得丹参素、盐酸伪麻黄碱、补骨脂苷、异补骨脂苷、迷迭香酸、丹酚酸B、补骨脂素、异补骨脂素、朝藿定C和淫羊藿苷的平均质量分数分别为1.864、0.375、3.900、3.106、0.166、0.585、0.245、0.198、0.420、0.467 mg·m L-1,RSD分别为1.71%、2.90%、1.62%、1.63%、1.74%、1.59%、2.73%、2.77%、1.41%、2.46%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验

精密量取已知待测成分含量的参仙升脉口服液1 m L(S10），共6份，分别按100%水平依次加入10个待测化合物的对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，计算得10个成分的平均加样回收率为99.0%～102.8%,RSD均小于3%，表明方法准确性良好。

2.4.7 样品测定

精密吸取10批参仙升脉口服液各0.1 m L，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，根据线性回归方程计算10个目标成分的含量，具体测定结果见表2。  

表2 10批参仙升脉口服液中10个成分含量测定结果（n=3)  

3、讨论

3.1 供试品溶液制备方法考察

参仙升脉口服液原液为水提液，本实验选用有机溶剂甲醇进行提取和稀释，分别考察了溶剂倍数为2、4、6、8和16，结果溶剂倍数为16倍时，色谱峰信息较为丰富，峰形较好，且相对峰面积大小较为合适，因此选择提取溶剂为16倍体积的甲醇。

3.2 色谱条件的优化

本实验对不同的检测波长（203、210、220、230、245、254、270、280、290、360 nm）进行了考察，发现分别在210和270 nm处有最大吸收；因参仙升脉口服液是由8味中药材制得，成分种类复杂，各成分性质差异大，仅在1个波长处，无法达到理想的分离效果，因此本实验利用HPLC的波长变换功能，分别在210 nm（盐酸伪麻黄碱、迷迭香酸、丹酚酸B、补骨脂素、异补骨脂素、朝藿定C、淫羊藿苷）和270 nm（丹参素、补骨脂苷、异补骨脂苷）波长处分时段实施测定。本实验分别对流动相种类（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸）和柱温（25、30、35、40℃进行了考察，结果以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相洗脱，柱温30℃时，得到的色谱峰信息最多，基线较为平稳，峰形及分离度也俱佳，因此最终选择流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，柱温为30℃。

3.3 指标成分的选择

参仙升脉口服液指纹图谱经对照品比对指认共有峰12个，参照2020年版《中国药典》[9]规定的处方组成中各味药材的质控指标成分，其中人参皂苷Rg1是红参的指标成分，盐酸伪麻黄碱是麻黄的指标成分，丹酚酸B是丹参的指标成分，补骨脂素和异补骨脂素是补骨脂的指标成分，朝藿定C和淫羊藿苷是淫羊藿的指标成分。此外，同样值得关注的是，丹参素和迷迭香酸既是丹参重要的活性成分[10,11,12]，也是参仙升脉口服液潜在的质量标志物[13]；补骨脂苷和异补骨脂苷是补骨脂的重要活性成分，在一定条件下可转化为补骨脂素和异补骨脂素[14,15]，也是所有检测成分中占比最高的2个成分。因此，以上所述成分，除人参皂苷Rg1不适于在本实验所建方法下准确定量外，其余10种成分均纳入参仙升脉口服液含量测定指标成分，以全面反映参仙升脉口服液的质量。

本研究采用HPLC波长切换法建立了参仙升脉口服液的指纹图谱，同时又测定了10个重要活性成分的含量，既可全面、系统地定性鉴别参仙升脉口服液的质量，又实现了多指标成分的定量分析，为有效控制参仙升脉口服液质量提供更加全面的科学依据。

参考文献:

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[15]李卓柯,孙婷婷,刘洋,等.基于潜在肝毒性成分分析的补骨脂炮制减毒机制[J].中药材, 2021, 44(9):2085-2088.

基金资助:陕西省重点研发计划项目(2021ZDLSF04-06,2022ZDXM-SF-06);陕西省“秦药”研发重点实验室项目(2021-QYPT-001);秦创园中医药创新研发转化项目(2022-QCYZH-006); 陕西省中医药管理局“秦药”开发重点科学研究项目(2021-02-ZZ-019);陕西中医药大学中医体质与疾病防治省级重点实验室开放课题(KF2210);

文章来源:宗时宇,张红,李晔等.参仙升脉口服液HPLC指纹图谱研究及多指标成分定量分析[J].药物评价研究,2024,47(02):353-359.