金樱子为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx.的干燥成熟果实，具有涩肠止泻、固崩止带和固精缩尿的作用，临床主要用于遗尿尿频、遗精滑精、久泻久痢和崩漏带下[1]。现代研究表明，金樱子具有保肾、抗菌抗炎、调节免疫、心血管保护等作用[2,3]。金樱子主要成分包括黄酮类、三萜类、鞣质类、苯丙素类、甾体类和多糖类等[2,4]。其收载于《中国药典》2020年版，仅对金樱子多糖进行了定量控制[1]，对其整体质量评价存在一定的不足。金樱子为葆宫止血颗粒中主要药味之一，本研究收集广西、贵州、广东、安徽、江苏、江西、湖南和湖北等8省16批金樱子药材，采用HPLC法同时测定蔷薇酸、委陵菜酸、熊果酸、没食子酸、儿茶素、橙皮苷、芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素和鞣花酸含量，建立金樱子多组分定量控制模式，采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）等化学计量学方法筛选影响金樱子产品质量的主要潜在标志物，利用熵权优劣解距离法（EW-TOPSIS）建立金樱子质量优劣评价模型，以期为金樱子整体质量控制提供科学的实验依据，同时为金樱子道地研究提供数据支撑。

1、材料

1.1 试药

对照品熊果酸（批号110742-201823，质量分数99.9%）、槲皮素（批号100081-201610，质量分数99.1%）、芹菜素（批号111901-202205，质量分数98.4%）、山柰酚（批号110861-202214，质量分数97.4%）、橙皮苷（批号110721-202220，质量分数97.2%）、儿茶素（批号110877-202306，质量分数96.6%）、木犀草素（批号111520-202107，质量分数96.3%）、芦丁（批号100080-202012，质量分数92.2%）、没食子酸（批号110831-201906，质量分数91.5%）、鞣花酸（批号111959-201903，质量分数88.8%）均由中国食品药品检定研究院提供；蔷薇酸（批号PRF22061404，质量分数95.6%）、委陵菜酸（批号PRF22021441，质量分数97.4%）由成都普瑞法科技开发有限公司提供；金樱子药材采集地信息见表1，经翟英英副主任药师鉴定为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx.的干燥成熟果实；乙腈和磷酸为色谱纯，其他试剂为分析纯。

1.2 仪器

Ulti Mate 3000型HPLC仪（美国赛默飞世尔科技公司）；BP211D型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

表1 16批样品采集地信息  

2、方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

精密称取蔷薇酸、委陵菜酸、熊果酸、橙皮苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚和芹菜素对照品适量，用75%甲醇制成质量浓度分别为0.042、0.026、0.058、0.102、0.076、0.038、0.054、0.032 mg·m L-1的混合贮备液；精密称取没食子酸和芦丁适量，用75%甲醇制成质量浓度分别为0.432、0.170 mg·m L-1的混合储备液；精密称取儿茶素和鞣花酸对照品适量，用75%甲醇制成质量浓度分别为0.830、1.160 mg·m L-1的混合储备液。依次精密吸取上述3个贮备液0.5、1.0、2.0 m L，置于同一20 m L量瓶中，用75%甲醇稀释至刻度，制成蔷薇酸、委陵菜酸、熊果酸、没食子酸、儿茶素、橙皮苷、芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素和鞣花酸质量浓度分别为1.05、0.65、1.45、21.60、83.00、2.55、8.50、1.90、0.95、1.35、0.80、116.00µg·m L-1的混合对照品溶液，0.22μm微孔滤膜滤过，备用。

2.2 供试品溶液的制备

取金樱子粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精确加入75%甲醇25 m L，称定质量，置水浴中回流提取60 min，冷却，补足质量，摇匀，静置，0.22μm微孔滤膜滤过，备用。

2.3 色谱条件

Global Chromatography C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）；检测波长：0～21 min 210 nm检测蔷薇酸、委陵菜酸和熊果酸，21～33 min 280 nm检测没食子酸、儿茶素和橙皮苷，33～55 min 350 nm检测芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素和鞣花酸；流动相为0.1%磷酸（A）-乙腈（B），体积流量1.0 m L·min-1，梯度洗脱条件：0～12 min,25.0%B;12～21 min,25.0%→32.0%B;21～33 min,32.0%→50.0%B;33～48 min,50.0%→62.0%B;48～52 min,62.0%→70.0%B;52～55 min,70.0%→25.0%B；进样量10µL，柱温30℃。供试品溶液与对照品吸收峰位置相同，12种成分色谱峰对称度良好，与相邻色谱峰分离符合《中国药典》要求。色谱图见图1。

图1 对照品（A）、供试品（B）、空白溶剂（C）高效液相色谱图   

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系考察

依次精密吸取“2.1”项3个混合贮备液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 m L，分别置于6个20 m L量瓶中，用75%甲醇稀释至刻度，制成6个混合对照品溶液。各精密吸取10µL进样，记录峰面积。以质量浓度对峰面积进行线性回归分析，结果见表2。结果表明线性关系良好，标准曲线适合用于含量测定。

2.4.2 方法学考察

精密度试验：精密吸取经微孔滤膜滤过的金樱子（S1）供试品溶液10µL，重复进样6次，检测峰面积，蔷薇酸、委陵菜酸、熊果酸、没食子酸、儿茶素、橙皮苷、芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素和鞣花酸峰面积的RSD值均小于2.0%。  

表2 金樱子中12个成分的线性关系  

稳定性试验：取1份金樱子（S1）供试品溶液，制备后经微孔滤膜滤过，每隔2 h进样1次，持续检测至24 h，检测峰面积，蔷薇酸、委陵菜酸、熊果酸、没食子酸、儿茶素、橙皮苷、芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、鞣花酸峰面积的RSD值均小于2.0%。

重复性试验：取金樱子（S1）样品6份，分别按供试品制备流程制成供试品溶液，各精密吸取10µL，检测峰面积，以峰面积外标法计算含量，蔷薇酸、委陵菜酸、熊果酸、没食子酸、儿茶素、橙皮苷、芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、鞣花酸含量的RSD值均小于2.0%。

加样回收率试验：取9份已知12种成分含量的金樱子（S1）干燥细粉各0.5 g，精密称定，按已知各成分含量的80%、100%、120%加入混合对照品溶液，再按供试品制备流程制成加样供试品溶液，每个浓度3份，各精密吸取10µL进样测定，按《药典》四部（9101）的方法计算平均加样回收率（RSD）分别为蔷薇酸96.97%(1.33%）、委陵菜酸97.46%(1.52%）、熊果酸97.62%(1.38%）、没食子酸97.85%(1.56%）、儿茶素100.05%(0.72%）、橙皮苷97.89%(1.55%）、芦丁98.23%(1.16%）、槲皮素97.99%(1.26%）、木犀草素97.63%(1.17%）、山柰酚96.94%(1.05%）、芹菜素97.82%(1.15%）和鞣花酸100.03%(1.12%）。结果均符合《中国药典》要求，表明建立的方法准确度高。

2.5 含量测定

取16批金樱子样品（S1～S16），按供试品溶液制备流程制成供试品溶液（每批平行3份），精密吸取10µL检测，记录峰面积，加载“2.4.1”项的标准曲线，按峰面积外标法计算样品含量，结果见表3。

2.6 化学计量学评价模式的建立

PCA将原有变量通过线性组合方式综合成少数几个综合指标（主成分），用主成分代替原有变量参与数据建模，降低了数据分析工作量，同时保留原有变量绝大部分信息。以16批金樱子中蔷薇酸、委陵菜酸、熊果酸、没食子酸、儿茶素、橙皮苷、芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素和鞣花酸12个成分含量数据为变量，应用软件SIMCA 14.1对变量组成的16×12矩阵数据构建PCA模型，结果提取出2个主成分，16批金樱子样品大致分成3区，S1～S6聚焦1个区，S7～S10聚焦1个区，S11～S16聚焦1个区，所有数据点均在95%置信区间内（图2），表明所有检测数据未见异常。为筛选影响品质的主要因子，继续进行有监督模式的OPLS-DA，结果各区散点更集中，分类更明显，其中模型参数，表明OPLS-DA模型预测能力好[5]（图3、4）。图4显示VIP>1的组分分别为鞣花酸、儿茶素、槲皮素和没食子酸，VIP值依次为2.097 6、1.849 3、1.046 5、1.010 1，表明上述4个组分对金樱子品质分组起决定性作用，是影响品质的主要因子[6]。  

表3 金樱子中12个成分含量（n=3)  

2.7 EW-TOPSIS分析

中药材及中药饮片质量是当前中药质量评价领域重点关注的问题。EW-TOPSIS模型非常适合于化学成分复杂中药材的质量评价和分级，具有数据量大、科学、直观、精准等优点，越来越多地被用于中药材的质量评价中[7,8,9,10]。以16批金樱子样品中蔷薇酸、委陵菜酸、熊果酸、没食子酸、儿茶素、橙皮苷、芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、鞣花酸12个组分的含量值为，组成多指标决策矩阵。因12个指标成分均为药效成分，属于越大越优型指标，根据正向指标公式：对决策矩阵进行归一化[7]。再将“2.6”项中12个组分的VIP值作为权重，将归一化后的数据与各组分权重相乘，得加权决策矩阵，矩阵结果见表4。以表4中每一组分的最大值为最优方案Z+，最小值为最劣方案Z-，则12个指标的Z+依次为0.247 1、0.189 2、1.0380、1.061 0、1.841 8、0.382 4、0.577 3、1.118 3、0.211 3、0.244 0、0.176 3和2.107 7,Z-均为0。再按最优向量欧氏距离计算公式和最差向量欧氏距离计算公式分别计算值，最后根据公式计算相对贴近度（Jb），并根据Jb大小对样品质量进行排序（表5）。结果显示S11～S16位于排名前6位，S1～S6位于排名中间6位，S7～S10位于排名后4位，排名越靠前，产品质量越优。

图2 PCA得分图  

图3 16批金樱子OPLS-DA得分图  

图4 16批金樱子VIP图   

3、讨论

3.1 供试品提取方式的确定

本研究首先考察了一定梯度浓度的甲醇液：50%甲醇、75%甲醇、甲醇，结果发现75%甲醇提取时，所测12种成分的响应值最高。进而以75%甲醇为溶剂，采用超声和水浴回流，对比10、30、45、60 min的提取效果，发现75%甲醇水浴回流提取60 min时，12种成分的提取率最高。

3.2 检测波长的选择

金樱子中待检测组分蔷薇酸、委陵菜酸、熊果酸、没食子酸、儿茶素、橙皮苷、芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、鞣花酸检测波长主要集中在200～400 nm。综合色谱峰丰度、基线平稳情况、色谱峰数量等情况，最终选择波长210 nm检测蔷薇酸、委陵菜酸和熊果酸[11,12,13,14];280 nm检测没食子酸、儿茶素和橙皮苷[15,16,17];350 nm检测芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素和鞣花酸[18,19,20,21]。

3.3 指标成分的选择

金樱子主要成分包括黄酮类、三萜类、鞣质类、苯丙素类、甾体类和多糖类等，其主要作用为抗氧化和调节免疫，降糖调脂、保护肝肾及心血管等多种药理作用都与其有关，还具有抑菌消炎、抗肿瘤等作用[22,23]。研究表明，蔷薇酸、委陵菜酸和熊果酸属于三萜类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、溶血及杀软体动物等活性，同时还具有降低胆固醇及抗高血脂、抗心肌缺血、提高记忆、抗生育等作用[24]；没食子酸又名五倍子酸，属于多酚类化合物，具有抗菌消炎、抗氧化、保护心血管系统、保护神经系统、抗糖尿病、抗肝纤维化、抗肿瘤等作用[25,26]；儿茶素、橙皮苷、芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚和芹菜素属于黄酮类化合物，总黄酮可改善高脂血症大鼠脂代谢紊乱，能降低大鼠全血黏度，有一定的抑制血小板聚集作用[27]；鞣花酸为鞣质类物质，是金樱子发挥收敛止血、抗氧化、抗病毒等作用的主要有效成分之一[2,28]。故选取以上12个成分作为指标成分进行定量分析。

本研究以8个省不同产地的16批金樱子为检测样品，采用ESM法对金樱子所含的蔷薇酸、委陵菜酸、熊果酸、没食子酸、儿茶素、橙皮苷、芦丁、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素和鞣花酸等成分进行定量分析，含量测定结果表明，不同产地的金樱子各成分含量存在差异，难以直观评价，因此需要适宜的分析方法对其多元活性成分进行综合评价。进而结合化学计量学对检测结果进行分析，结果显示同一产地的金樱子质量相对稳定，不同产地金樱子中12个组分含量差异较大。本研究建立了金樱子12种指标成分定量质控模式，所建立的方法简便可行、准确性好，为其质量标准提升提供研究基础，化学模式识别联合EW-TOPSIS法客观全面，可用于金樱子的整体质量评价，为其道地性研究提供数据支撑。  

表4 金樱子12个组分加权决策矩阵结果  

表5 金樱子药材质量评价结果  

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基金资助:河南省高等学校重点科研指导计划项目(编号20B460010);

文章来源:王娟娟,翟英英,王海燕.金樱子HPLC多组分定量控制及化学计量学综合质量评价[J].药物评价研究,2024,47(02):369-376.