肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌最常见的病理类型；居全球发病率的第五位，5年生存率仅为18%，位列癌症相关死亡原因的第三位[1]。有研究发现具有肝癌干细胞样细胞性质的HCC源性球细胞是HCC天然耐药的“根源”[2,3]。本课题组前期研究表明，低表达miR-34a-5p和过表达FoxM1能促成高转移MHCC97H细胞系源性球细胞自我更新相关干性形成[4]。然而，miR-34a-5p/FoxM1/c-Myc信号通路是否与MHCC97H源性球细胞化疗耐药相关有待深入研究。

在体内外，芹菜素(4'，5，7-三羟基黄酮，apigenin，API)能有效抑制HCC细胞增殖和生长[5,6,7]。本课题组也证实API(10、20、40 μmol·L-1)能减弱HCC源性球细胞(包括高转移MHCC97H细胞系源性球细胞)自我更新相关干性[8,9]。Erdogan等[10]研究表明API能增强人前列腺癌CD44阳性球细胞对顺铂的敏感性。Aida等[11]报道miR-34a-5p促进API处理的肺癌细胞凋亡。Yang等[12]发现miR-34a-5p直接靶向抑制Bcl-2表达，并增强索拉菲尼对人HCC细胞的敏感性。Chen等[13]发现miR-375/FoxM1/c-Myc信号途径导致结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)的耐药。本课题组前期研究结果亦表明API糖苷类化合物异牡荆素通过上调miR-34a-5p抑制HCC的SK-Hep-1球细胞自我更新和诱导细胞凋亡[14]。然而，API调节HCC细胞关键miRNA(例如miR-34a-5p)方面的研究尚不充分，需要进一步探讨。

基于临床上5-FU仍然是HCC患者的主要治疗药物之一，本文旨在确定API能否增强MHCC97H源性球细胞(MH-SFC)的5-FU敏感性，以及其分子机制是否涉及调节miR-34a-5p/FoxM1/c-Myc信号途径。

1、材料

MHCC97H细胞系(中国科学院细胞库)；24孔超低黏附培养板(美国Corning Inc 公司)。胰岛素、API(批号：520-36-5)、5-FU(批号：51-21-8)、牛血清白蛋白(BSA)和胰岛素(美国Sigma-Aldrich公司)；青霉素、链霉素、hrEGF、hbFGF、B27、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000、重组人表皮生长因子、重组成纤维细胞生长因子、不含维生素A 的B27 添加物(Invitrogen公司)；抗FoxM1、C-Myc抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG二抗(碧云天生物技术研究所)；增强化学发光检测试剂(美国Amersham Pharmacia Biotech 公司)。无血清DMEM/F12、DMEM/F12培养基(美国GIBCO公司)。CCK-8试剂盒(Beyotime)。miRcute miRNA分离试剂盒(中国天根生化有限公司)；Anti-34a(RiboBio公司)；All-in-One miRNA First-Strand cDNA Synthesis试剂盒(美国Genecopoeia公司)。

2、方法与结果

2.1 细胞培养

2.1.1 MHCC97H细胞培养

MHCC97H细胞用含10%FBS的DMEM培养基置于37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱培养。

2.1.2 MH-SFC细胞的培养[9]

MHCC97H细胞用添加100 IU·mL-1 青霉素、100 μg·mL-1 链霉素、20 ng·mL-1 hrEGF、20 ng·mL-1 hbFGF、2% B27、0.4% BSA和4 μg·mL-1胰岛素的无血清DMEM/F12，即肿瘤干细胞培养基，以每孔2×103个细胞密度接种于24孔超低黏附培养板，悬浮培养6 d，得到MHCC97H 细胞源性球细胞(MH-SFC)。

2.2 API对MH-SFC细胞存活力的影响

不同浓度5-FU(1、3、10、30、100 μmol·L-1)或API(10、20、40、80、160、320 μmol·L-1)分别孵育MH-SFC和MHCC97H细胞48 h；以加入溶媒[0.1%二甲基亚砜(DMSO)]为空白对照组。CCK-8试剂盒测定细胞存活力(处理组吸光度A450值/空白对照组吸光度A450值×100%)。利用GraphPad.Prism.v5.0-IC50值计算软件(https：//www.aatbio.com/tools/ic50-calculator)计算5-FU或API对细胞存活力的半数抑制浓度(IC50)，并计算5-FU的耐药指数[IC50(MHCC97H)/IC50(MH-SFC)]和API的敏感系数[IC50(MHCC97H)/ IC50(MH-SFC)][15,16]。

结果显示MHCC97H细胞呈多边形，单层贴壁生长。MH-SFC呈球状悬浮生长；CCK-8测定结果显示：与MHCC97H细胞(10.37 μmol·L-1)相比，5-FU抑制MH-SFC活力的IC50(24.26 μmol·L-1)增高(见图1)，说明5-FU 对MH-SFC天然耐药，耐药指数为2.34。

表1结果显示：API能有效抑制MH-SFC和MHCC97H细胞存活力，IC50分别为104.24、181.74 μmol·L-1，表明API能优先抑制MH-SFC的细胞存活力；其敏感系数为1.74。

图1 MHCC97H细胞(×100)与MH-SFC细胞(×400)的形态特征及对5-FU的IC50(n=3)

表1 不同浓度API对MH-SFC细胞存活力的抑制率(n=3)

2.3 API对MH-SFC细胞的5-FU敏感性的影响

CCK-8检测不同浓度API(10、40 μmol • L-1)预处理MH-SFC细胞12 h后联合5-FU 的IC50，结果10 μmol·L-1API(单独孵育MH-SFC的细胞存活力抑制率<10%)和40 μmol·L-1API(单独孵育MH-SFC的细胞存活力抑制率<25%)有效地降低了5-FU抑制MH-SFC细胞存活力的IC50(见图2)。计算API对MH-SFC细胞的5-FU增敏系数[IC50(5-FU)/ IC50(API+5-FU)][16]。结果说明10 μmol·L-1和40 μmol·L-1 API对MH-SFC细胞有5-FU增敏效应，增敏系数分别为1.23和1.68。

2.4 Anti-34a对API增强MH-SFC的5-FU敏感性作用的影响

图2 芹菜素对MH-SFC 细胞的5-FU 敏感性的影响(n=3)

参照文献[4,14]方法，用miRcute miRNA分离试剂盒从MH-SFC(1×105)或MHCC97H细胞(1×105)中制备总miRNA。依据All-in-One miRNA First-Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书的步骤，应用qRT-PCR分析miR-34a-5p表达水平。结果表明MH-SFC较MHCC97H细胞更低表达miR-34a-5p(见图3A)，API(10、40 μmol ·L-1)处理能增高MH-SFC的miR-34a-5p表达水平(见图3B)。

图3 芹菜素对MH-SFC细胞中miR-34a-5p 表达的影响(n=3)

参照文献[4]方法，分别用miR-34a-5p抑制物(Anti-34a)和miR-34a-5p阴性对照(miR-NC)转染MH-SFC细胞。为了测定API或Anti-34a或两者合用对MH-SFC细胞的5-FU敏感性的影响，用API(10.0、40.0 μmol·L-1)预处理或Anti-34a转染与API(40 μmol·L-1)单独或共处理MH-SFC细胞12 h；随后，检测5-FU IC50，分析miR-34a-5p表达水平。结果显示Anti-34a能消除40 μmol·L-1 API降低5-FU IC50和上调miR-34a-5p表达的作用(见图4)。结果表明API可能通过上调miR-34a-5p表达，进而增强MH-SFC细胞的5-FU敏感性。

2.5 Anti-34a对API下调MH-SFC miR-34a-5p 靶基因产物FoxM1和c-Myc表达效应的影响

图4 Anti-34a对API 增强MH-SFC细胞的5-FU敏感性的影响(n=3)   

Fig 4 Effect of Anti-34a on the enhance of API on MH-SFC cell sensitivity to 5-FU(n=3)

注：与对照组相比，*P<0.05；与40 μmol ·L-1API处理组相比，#P<0.05；与单独用Anti-34a转染相比，$P<0.05。

Note：vs the control group，*P<0.05；vs the group treated with API(40.0 μmol·L-1)alone，#P<0.05；vs the group transfected with Anti-34a alone，$P<0.05.

参照文献[13]方法，Western blot分析API(10、40 μmol·L-1)对MH-SFC的FoxM1和C-Myc蛋白表达的影响。结果证明，API能降低MH-SFC 的FoxM1和C-myc蛋白表达水平(见图5)。

图5 API对MH-SFC FoxM1(A)和c-Myc(B)蛋白表达的影响(n=3)

按照“2.4”项下方法，用Anti-34a和miR-NC转染MH-SFC。实验分成4组，第一组为未处理组，第二组为API(40 μmol·L-1)单独处理组，第三组为mi-RNA-34a抑制物单独转染组(Anti-34a),第四组为API(40 μmol·L-1)与Anti-34a联合处理组。随后，各组均处理MH-SFC 细胞 12 h；Western blot分析FoxM1和C-Myc蛋白表达水平。结果表明，Anti-34a能拮抗40 μmol·L-1的API下调MH-SFC FoxM1和c-Myc蛋白表达作用(见图6)。

2.6 统计学分析

图6 Anti-34a 对API 下调MH-SFC FoxM1 和c-Myc 蛋白表达作用的影响(n=3)   

Fig 6 Effect of Anti-34a on the down-regulation of FoxM1 and c-Myc protein expressions induced by API in MH-SFC(n=3)

注：与对照组相比，*P<0.05；与40 μmol ·L-1API处理组相比，#P<0.05；与单独用Anti-34a转染相比，$P<0.05。

Note：vs the control group，*P<0.05；vs the group treated with API(40.0 μmol·L-1)alone，#P<0.05；vs the group transfected with Anti-34a alone，$P<0.05.

数据用SPSS 20.0 for windows evaluation 软件分析，表示为均数±标准差(±s)。两组均数的比较用Student’s t检验。多组均数的两两比较用One Way ANOVA方差分析的LSD法(方差齐)或Dunnett’s t检验(方差不齐)。P<0.05，检验假设有统计学意义。

3、讨论

大量研究结果显示，来自HCC细胞系和临床HCC患者的原代培养的球细胞具有肿瘤干细胞样细胞特性；可能是HCC天然多药耐药的根源[2,3]。Cao等[2]评估HCC PLC/PRF/5亲本细胞与第3代球细胞对顺铂的敏感性，结果显示3、5、9 μg·mL-1顺铂处理球细胞24 h后，相对细胞存活率分别增加1.5倍、2.1倍及2.3倍。此外，PLC/PRF/5源性球细胞展示出对氟尿嘧啶、阿糖胞苷、丝裂霉素、索拉非尼的普遍耐药性[2]。Ma等[3]发现相比于各自的亲本细胞，应用体外培养Huh7和Hep3B源性球细胞对高浓度5-FU(80 μmol·L-1)、索拉非尼(5 μmol·L-1)和阿霉素(2 μmol·L-1)处理具有更大的耐受性。本课题组前期研究显示，API优先抑制MH-SFC的细胞存活力和肝癌球形成效率[9]，本研究结果与之类似：MH-SFC对5-FU天然耐药。通过系统的量效关系研究，进一步确证了API对MH-SFC细胞存活力抑制作用更强。同时证明API具有增强5-FU抑制 MH-SFC细胞存活力作用。说明API能作为靶向肿瘤干细胞样细胞(MH-SFC)的化疗增敏剂的优良药效学特性。

MiR-3-5p是一种与肿瘤发生有关并已经充分研究的miRNA，通常在多种恶性肿瘤(包括骨肉瘤[17]、结直肠癌[18]和HCC[4,14])中下调。值得注意的是，miR-34a-5p能抑制骨肉瘤、结直肠癌和HCC肿瘤干细胞样细胞自我更新功能[4,14,17,18]。Zhang等[19]研究表明miR-34a模拟物可增强结直肠癌细胞对5-FU的敏感性。新近的研究显示miR-34a-5p-c-MYC-CHK1/CHK2轴抑制DNA损伤反应，减弱肿瘤干细胞样细胞特性并增强HCC放疗敏感性[20]。本课题组前期研究亦证明：低表达miR-34a-5p和过表达FoxM1促成MH-SFC细胞自我更新相关干性形成[4]，同时，芹菜素糖苷类化合物异牡荆素通过上调miR-34a-5p抑制肝细胞癌SK-Hep-1球细胞干性和诱导细胞凋亡[14]。然而，miR-34a-5p对MH-SFC细胞的5-FU敏感性的影响及潜在机制值得进一步研究。本文的结果再次验证了MH-SFC细胞展示出更低表达miR-34a-5p分子表型；且发现API能有效地上调MH-SFC细胞的miR-34a-5p表达，Anti-34a几乎能消除API上调miR-34a-5p表达和增强MH-SFC细胞5-FU敏感性作用。这提示API对天然耐药MH-SFC细胞的化疗增敏机制主要通过上调miR-34a-5p表达。

FoxM1是一种与肿瘤干细胞样细胞特性关联的致癌性转录因子[4]。Huang等[21]报道CRISPR/Cas9敲除人结直肠癌HCT116细胞miR-34a/b/c表达，上调miR-34a靶基因FoxM1，并诱导p62 和ATG9A表达，这些分子变动能增加细胞自噬，随后，减弱凋亡以赋予miR-34a/b/c敲除细胞更趋向5-FU耐药。Chen等[13]发现miR-375/FoxM1/c-Myc通路导致结直肠癌细胞对5-FU耐药。Liu等[22]通过生信学分析指出：过表达FoxM1引起包括c-Myc在内的多条信号途径失调，是一个肝内胆管上皮癌预后不良的预测指标。Koo等[23]证实桑根皮素通过活性氧介导FoxM1/c-Myc信号的抑制，促进肿瘤细胞凋亡和抑制有氧糖酵解。本研究结果显示API下调FoxM1和c-Myc蛋白表达，这些作用能被Anti-34a大部分消除。但是关于API上调miR-34a-5p是否通过直接靶向靶基因FoxM1和c-Myc增强MH-SFC细胞的5-FU敏感性的具体机制还有待进一步研究。

综上所述，本文的结果显示API增强MH-SFC细胞的5-FU敏感性作用涉及上调miR-34a-5p表达，可能通过靶向抑制FoxM1表达阻断FoxM1/c-Myc信号传导通路。

参考文献:

[5]高爱梅,程晓莉.芹菜素对裸鼠肝癌皮下移植瘤抑制作用的研究[J].中国医药导报,2017,14(26):9-12.

[6]邸金霖,单万亭,赵娇,等.芹菜素联合阿霉素对肝癌Hep G2细胞增殖,凋亡及细胞周期的影响[J].中医药学报,2021,49(5):31-34.

[8]姜素芳,许畅,陈阿,等.芹菜素对肝细胞癌 SMMC-7721 细胞系干样细胞自我更新及CK2α 表达的影响[J].湖南师范大学学报(医学版),2017,14(5):1-3.

[9]崔迎红,陈阿,许畅,等.芹菜素上调SHP-1蛋白表达抑制肝癌 MHCC97H 细胞 STAT3磷酸化及球形成[J].湖南师范大学学报(医学版),2018,15(5):1-4.

[15]武帅,周灿灿,韩亮,等.白藜芦醇通过抑制PARP1促进胰腺癌对吉西他滨的化疗敏感性[J].西安交通大学学报(医学版),2022,43(6):850-855.

[16]来芳芳,李杰,季鸣,等.奥拉帕尼对Taxol抗乳腺癌4T1的增敏作用[J].药学学报,2016,51(6):907-912.

基金资助:国家自然科学基金项目(No.82074075);

文章来源:乐伊婕,曹建国,杨小红,等.芹菜素对MHCC97H源性球细胞对5-氟尿嘧啶敏感性的影响[J].中南药学,2024,22(06):1566-1571.