肝癌发病率每年都在增加[1]，且死亡率极高，不少国家的肝癌致死病例在肿瘤相关死亡病例中居前三位[2]。目前手术仍然是治疗肝癌的首选方法，但存在术后复发的可能[3]，而且术后并发症对患者的预后影响也不容小觑。因此，探索更有效且副作用小的肝癌治疗方法极为重要。中医药治疗在控制患者病情、减少后遗症等方面发挥着重要作用[4]。鱼腥草（Herba Houttuyniae）为蕺菜属一种，其主要活性成分包括生物碱、挥发油类、黄酮类等[5]。已有研究证实鱼腥草具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗癌作用[6⁃7]，能抑制肺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤细胞增殖[8]，但目前尚不清楚鱼腥草治疗肝癌的作用机制。

网络药理学作为现代中医药理学研究的一个新领域，是揭示中医药配方药理机制的一种有前途的方法[9]。目前通过网络药理学的方法，已经从基础实验层面揭示了左桂丸[10]、假马齿苋[11]、白花蛇舌草[12]等中医药治疗肝癌的分子机制，有望为临床治疗肝癌提供新的治疗药物和方法。本研究使用细胞实验探讨鱼腥草治疗肝癌的效果，并通过网络药理学方法构建鱼腥草⁃肝癌的活性成分及作用靶点网络，挖掘潜在治疗靶点并通过实验验证，以期明确鱼腥草治疗肝癌的作用机制，为临床治疗提供参考。

1、材料与方法

1.1 主要材料及试剂

人源性肝癌细胞系SMMC⁃7721、SK⁃Hep⁃1购自武汉尚恩生物技术有限公司；青链霉素混合液（G4003⁃100ML）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；鱼腥草提取物（JY⁃A0516257）购自高教研（北京）科技有限公司；CCK⁃8试剂（C0042）购自广州誉维生物科技仪器有限公司；高糖DMEM培养基（C11995500BT）购自广州辰星生物科技发展有限公司；胎牛血清（FND500）购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司；活性氧（ROS）检测试剂盒（S0033S）购自上海碧云天生物技术股份有限公司；结晶紫（C805211⁃25g）购自广州可乐生物科技有限公司；RNAiso Plus(9109）购自广州市齐云生物技术有限公司；GoScriptTMReverse Transcription Mix试剂盒（A2800）购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒（B21202）购自美国Bimake生物科技有限公司；TUNEL试剂盒（RC0088）购自上海茹创生物科技有限公司；蛋白裂解液（20⁃188）购自美国Millipore公司；山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor®488）二抗（ab150077）、山羊抗兔Ig G H&L(IRDye®800CW）二抗（ab216773）、MMP⁃9(ab92536）、BCL2(ab182858）、BAX(ab32503）抗体均购自美国Abcam公司，β⁃actin(3700）抗体购自南京多生利生物工程有限公司。

1.2 细胞培养

SMMC⁃7721和SK⁃Hep⁃1细胞均接种于含1%双抗和10%胎牛血清的DMEM培养基中，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养。待细胞生长密度≥80%时，使用胰酶进行消化并传代，取对数生长期的肝癌细胞用于后续实验。

1.3 CCK⁃8细胞活性检测实验

以3×103个/孔的密度将SMMC⁃7721和SK⁃Hep⁃1细胞分别接种于96孔板内，每组6个复孔。培养12 h后，分别给予已用DMEM培养基稀释成不同浓度（0、0.01、0.10、0.05、1.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00µg/mL）的鱼腥草提取液处理48h，弃去上清液，加入100µL 10%的CCK⁃8溶液，37℃避光孵育2～4 h，用酶标仪于2、3、4 h时间点分别测定450 nm波长处吸光值。细胞活力（%）=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%。As为实验组吸光度，Ac为对照组吸光度，Ab为空白组吸光度。

1.4 Transwell实验检测迁移和侵袭能力

SMMC⁃7721细胞分别用浓度为0、10.00、20.00µg/m L的鱼腥草提取物处理，SK⁃Hep⁃1细胞分别用浓度为0、10.00、25.00µg/mL的鱼腥草提取物处理。

迁移实验：将处于对数生长期的SMMC⁃7721和SK⁃Hep⁃1细胞用含上述不同浓度的鱼腥草提取物的无血清DMEM培养基重悬后，调整细胞密度为1.5×105个/mL。各取100µL加入到Transwell小室的上室；同时，下室加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基。24 h后擦除Transwell上室滤膜上表层的细胞，结晶紫染色20 min，使用普通显微镜观察并拍照，随机选取5个视野计数，使用ImageJ软件进行定量分析。侵袭实验：预先在Transwell小室的上室孵育含有0.1%基质胶的培养基4 h，其余步骤同迁移实验。

1.5 ROS检测试剂盒检测细胞ROS水平

使用“1.4”处理浓度的鱼腥草提取物处理SMMC⁃7721和SK⁃Hep⁃1细胞，调整细胞密度为3×103个/mL，培养48 h后弃去上清液，PBS清洗。按ROS检测试剂盒说明书使用ROS荧光探针将细胞染色30 min，用PBS洗涤细胞以去除多余探针，使用荧光显微镜观察并拍摄荧光图片，使用ImageJ软件进行定量分析。

1.6 TUNEL染色检测细胞凋亡情况

以3×103个/孔的密度将SMMC⁃7721和SK⁃Hep⁃1细胞接种于含“1.4”处理浓度的鱼腥草提取物的DMEM培养基中，培养48 h后，根据TUNEL试剂盒说明书步骤，向每孔加入500µL TUNEL染色液，置于37℃培养箱避光孵育1 h。随后使用PBS充分清洗，加入1µg/mL的DAPI溶液，室温孵育10 min，使用纸巾吸走残余液体，用荧光显微镜观察并拍摄荧光图片，使用ImageJ软件进行定量分析。

1.7 qRT⁃PCR检测细胞mRNA的表达水平

收集按“1.4”浓度处理的细胞，根据RNAiso Plus试剂说明书提取总RNA并测定每组RNA浓度和纯度。根据GoScriptTMReverse Transcription Mix试剂盒说明书将RNA样本反转录生成cDNA，根据2×SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒说明书配置qRT⁃PCR反应体系，以cDNA为模板使用荧光定量PCR仪进行PCR扩增。反应条件：95℃预变性5 min,95℃变性15 s,60℃退火30 s,40个循环。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物设计如表1。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA表达水平。 

表1 PCR引物序列

1.8 Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白表达水平

收集按“1.4”浓度处理的肝癌细胞，加入蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液进行裂解，并使用超声仪震碎。根据蛋白裂解液试剂说明书的方案提取细胞蛋白于-80℃冰箱保存。将细胞蛋白样品（每泳道10µL）于SDS⁃PAGE凝胶中分离，随后转移到PVDF膜上。室温封闭1 h，加入稀释后BCL2、BAX、β⁃actin一抗（稀释比例均为1∶1 000),4°C摇床孵育过夜。次日TBST洗涤3次，每次5 min；于室温条件下与IRDye®800CW二抗（稀释比例为1∶15 000）孵育1 h;TBST洗涤3次，每次5 min；随后使用双色红外激光成像系统扫膜并使用ImageJ软件进行定量分析。

1.9 细胞免疫荧光染色

收集按“1.4”浓度处理的肝癌细胞，弃去上清液，使用4%多聚甲醛孵育15 min,PBS清洗后使用MMP⁃9一抗（稀释比例为1∶200）室温孵育2 h,PBS液洗涤3次后使用稀释后的Alexa Fluor®488二抗（稀释比例为1∶1 500）室温孵育1 h，洗涤后用DAPI染色10 min，使用荧光显微镜观察并拍摄免疫荧光图片。

1.1 0 网络药理学方法

1.1 0. 1 鱼腥草有效成分的筛选及靶点预测

在TCMSP数据库（访问时间为2023年12月）中检索鱼腥草成分，以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%，类药性（drug⁃likeness,DL）≥0.18筛选出其有效活性成分，通过Uniprot数据库和Cytoscape 3.9.1软件作鱼腥草的“有效活性成分⁃靶点”网络图。

1.1 0. 2 鱼腥草抗肝癌作用靶点的筛选

使用Genecards(https://www.genecards.org）、OMIM(https://www.omim.org）等数据库（访问时间均为2023年12月）以“hepato⁃carcinoma”、“HCC”为关键词收集肝癌相关基因，去除重复基因和假阳性基因后，确定肝癌的潜在作用靶点。通过venny2.1.0软件将鱼腥草靶点与肝癌靶点取交集，获得鱼腥草抗肝癌作用靶点并绘制韦恩图。

1.1 0. 3 蛋白间相互作用（PPI）网络的构建及核心靶点筛选

将鱼腥草抗肝癌作用靶点输入到String平台（https://cn.string⁃db.org/）（访问时间为2023年12月），研究物种为“Homo sapiens”，获取靶点相互作用关系（置信度0.7），去除没有相互作用关系的蛋白，构建PPI网络关系图。利用Cytoscape 3.9.1软件中的cytoNAC插件对PPI网络关系核心靶点进行筛选，计算度中心性（degree centrality,DC）值大小。

1.1 0. 4 GO和KEGG通路富集分析

将鱼腥草抗肝癌作用靶点导入Metascape(https://metascape.org/）数据库（访问时间为2023年12月）进行GO和KEGG通路富集分析，并利用微生信网站（http://www.bioinfor⁃matics.com.cn/）进行可视化。

1.11统计学方法

使用GraphPad Prism 9软件对数据进行统计分析，计量数据以均数±标准差表示。多组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD⁃t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 鱼腥草提取物对肝癌细胞活力、侵袭和迁移的影响

使用含不同浓度（0、0.01、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00µg/mL）的鱼腥草提取物的DMEM培养基培养SMMC⁃7721和SK⁃Hep⁃1细胞48 h后进行CCK⁃8实验，结果（图1A～B）显示，鱼腥草提取物为10.00µg/mL时SMMC⁃7721和SK⁃Hep⁃1细胞的活力都被明显抑制（均P<0.0001），且20.00µg/mL比10.00µg/mL的鱼腥草提取物对SMMC⁃7721细胞活力的抑制作用更强（P<0.05），但20.00µg/mL和25.00µg/mL的鱼腥草提取物对SMMC⁃7721细胞活力的影响差异无统计学意义（P>0.05），而25.00µg/mL比10.00µg/mL的鱼腥草提取物对SK⁃Hep⁃1细胞活力的抑制作用更强（P<0.05）。因此，使用10.00、20.00µg/mL的鱼腥草提取物处理SMMC⁃7721细胞，使用10.00、25.00µg/mL的鱼腥草提取物处理SK⁃Hep⁃1细胞，进行后续细胞实验。

Transwell实验结果（图1C～D）显示，不同浓度的鱼腥草提取物均抑制了SMMC⁃7721和SK⁃Hep⁃1细胞的迁移和侵袭能力（均P<0.05），其中20.00µg/mL比10.00µg/mL的鱼腥草提取物对SMMC⁃7721细胞的侵袭能力更强（P<0.01）。

细胞免疫荧光实验结果（图1E～F）显示，与未处理组相比，10.00、20.00µg/mL的鱼腥草提取物均可抑制SMMC⁃7721细胞表达转移相关蛋白MMP⁃9（均P<0.05);10.00、25.00µg/mL的鱼腥草提取物均可抑制SK⁃Hep⁃1细胞表达MMP⁃9蛋白（均P<0.05）。

2.2 鱼腥草提取物可促进肝癌细胞凋亡

ROS检测结果（图2A）显示，与未处理组相比，20.00µg/mL的鱼腥草提取物处理SMMC⁃7721细胞后ROS水平升高（P<0.05),10.00、25.00µg/mL的鱼腥草提取物处理SK⁃Hep⁃1细胞后ROS水平均升高（均P<0.05）。TUNEL染色实验结果（图2B～C）显示，与未处理组相比，20.00µg/mL的鱼腥草提取物可促进SMMC⁃7721细胞凋亡（P<0.01),10.00、25.00µg/mL的鱼腥草提取物均可促进SK⁃Hep⁃1细胞凋亡（均P<0.05）。Western blot结果（图2D～E）显示，20.00、25.00µg/mL的鱼腥草提取物分别增加了SMMC⁃7721和SK⁃Hep⁃1细胞中促凋亡蛋白BAX的表达水平（均P<0.05），但不影响抗凋亡蛋白BCL2的表达水平（均P>0.05）。

2.3 网络药理学筛选鱼腥草治疗肝癌的作用靶点

经TCMSP数据库筛选得到7个符合条件的鱼腥草有效化合物，包括槲皮素、山奈酚、C09746、1⁃甲基⁃2⁃九壬基⁃4⁃喹诺酮、异索马酮、脊柱甾醇、黄夹次苷丙。将所有靶点去重后使用Uniprot数据库和Cytoscape3.9.1软件构建“有效成分⁃靶点”网络图（图3A），共收集到142个靶点。从Genecards、OMIM数据库中检索获得1 799个肝癌相关靶点，将其与142个有效成分靶点绘制韦恩图（图3B），得到84个潜在靶点。将这84个共同靶点导入String数据库，获得PPI网络（图3C）。把PPI网络数据上传Cytoscape 3.9.1并借助cytoNAC插件进行核心靶点筛选，依据DC值依次筛选出排名前10的TNF、AKT1、IL⁃1β、MMP⁃9、PTGS2、TP53、CASP3、HIF1A、BCL2、EGFR等关键靶点（图3D）。最终选取排名前2的TNF、AKT1以及经典抑癌基因TP53作为核心靶点。

2.4 GO和KEGG通路富集分析

将上述84个鱼腥草抗肝癌作用靶点进行GO富集分析（图4A），结果显示这些靶点主要富集在细胞迁移的积极调节、炎症反应、氧化反应、对脂多糖的反应等生物过程，主要存在于膜筏、膜的侧面、细胞质的核周区域、细胞外基质等细胞组成部分，主要涉及细胞因子受体结合、蛋白质同二聚化活性、蛋白质结构域特异性结合、内肽酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析结果（图4B）显示，这些靶点主要富集在癌症、TNF、IL⁃17、PI3K⁃AKT、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌⁃受体激活等信号通路上。

2.5 鱼腥草提取物对肝癌细胞TNF⁃α、AKT1、TP53等基因的影响

qPCR结果显示（图5A～B），在SMMC⁃7721细胞中，与未处理组相比，10.00、20.00µg/mL的鱼腥草提取物均降低细胞TNF⁃α、AKT1基因的mRNA表达水平（均P<0.05），而20.00µg/mL的鱼腥草提取物则增加TP53基因的mRNA表达水平（P<0.01）；在SK⁃Hep⁃1细胞中，与未处理组相比，10.00、25.00µg/mL的鱼腥草提取物均降低细胞TNF⁃α、AKT1基因的mRNA表达水平（均P<0.05），但均增加TP53基因的mRNA表达水平（均P<0.01）。

图1 鱼腥草提取物对肝癌细胞活力、侵袭和迁移的影响

图2 鱼腥草提取物可促进肝癌细胞凋亡

图3 网络药理学方法筛选鱼腥草治疗肝癌的作用靶点

图4 GO和KEGG通路富集分析

图5 鱼腥草提取物影响肝癌细胞中TNF⁃α、AKT1和TP53基因的表达

3、讨论

肝癌晚期术后药物治疗易产生耐药性，对于晚期肝癌患者亟需更安全有效的治疗方案[13]。鱼腥草具有抗菌、抗癌、提高机体免疫力等作用，在临床上常被用于治疗肝炎等各种炎症[14]。本研究发现鱼腥草可抑制肝癌细胞SMMC⁃7721和SK⁃Hep⁃1的细胞活力、迁移能力和侵袭能力，并促进细胞凋亡。MMP⁃9具有降解细胞外基质，促进肿瘤转移的能力[15]。BAX是经典的促凋亡蛋白。在本研究中，鱼腥草抑制了SMMC⁃7721和SK⁃Hep⁃1细胞中MMP⁃9蛋白的表达，并促进BAX蛋白的表达。

本研究通过网络药理学结合实验发现鱼腥草治疗肝癌的潜在活性成分主要为槲皮素、山奈酚等，核心作用靶点蛋白为TNF、AKT1、TP53等，推测鱼腥草可能通过调节AKT1、TNF、TP53等靶点，发挥干预肝癌细胞生物学行为的作用。AKT1在大多数癌症中过度活跃，且有研究表明AKT1在诱导肝癌的发生方面有重要贡献[16]。AKT1在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，其降解可明显抑制肝癌细胞的增殖及侵袭能力[17]，抑制肝细胞癌中涉及RHOU/AKT1的信号通路可以延缓其迁移和生长[18]。另外，HISAKA等[19]研究发现，槲皮素对肝癌细胞的增殖具有抑制作用。槲皮素可能通过干扰caspase/Cyto⁃c信号通路和阻断AKT1/细胞外信号调节激酶（extracellular signal⁃regulated ki⁃nase,ERK)1/2信号通路的表达来抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡[20]。本研究发现槲皮素是鱼腥草治疗肝癌的潜在活性成分，并且使用鱼腥草处理肝癌细胞可明显抑制肝癌细胞表达AKT1。另外，本研究GO富集分析显示潜在治疗靶点主要富集在细胞迁移的积极调节、炎症反应、氧化反应、对脂多糖的反应等生物过程。KEGG通路富集分析结果显示，这些靶点主要富集在癌症、TNF、IL⁃17、PI3K⁃AKT等信号通路。其中TNF⁃α变异被认为会增加肝细胞癌发生的风险，这种危险因素在亚洲人群中更为突出[21]，而且TNF⁃α还被证实影响肿瘤细胞的侵袭和转移[22]。TNF⁃α在与其受体结合后会激活不同的信号通路，与慢性炎症的发生密切相关，最终可能导致自身免疫失调，从而间接增强了肿瘤细胞转移与增殖的能力[23]。在转基因肝癌小鼠的中，TNF⁃α信号通路促进了肝癌细胞的增殖及转移[24]。另外，山奈酚具有减弱TNF⁃α功能的作用，可促进肝癌细胞凋亡从而抑制其增殖[25]。本研究表明山奈酚是鱼腥草的有效活性成分之一，且鱼腥草提取物可抑制肝癌细胞中TNF⁃α的表达。TP53基因编码具有转录激活、DNA结合和寡聚化域的肿瘤抑制蛋白，能诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老[26]。TP53基因的突变与多种人类癌症有关，TP53缺失可驱动肝癌的发生，促进肝癌细胞的增殖[27]。本研究的体外实验也表明鱼腥草提取物可以促进TP53的表达。

综上所述，本研究发现鱼腥草可抑制肝癌细胞的细胞活力及迁移和侵袭能力，且促进肝癌细胞凋亡，其中的机制可能是鱼腥草通过调节TNF、AKT1、TP53等基因影响肝癌细胞的生物学行为。由此可推断，鱼腥草可能是一个治疗肝癌的候选药物。但后续仍需开展动物实验进一步明确鱼腥草治疗肝癌的疗效及其对预测的关键靶点及信号通路的影响，为鱼腥草治疗肝癌提供更充分的理论依据。

参考文献：

[3]吴飞翔,王方为,马良,等.原发性肝癌术后复发246例再治疗的近期疗效[J].中国癌症防治杂志,2012,4(2):167-170.

[4]张宇,陈华国,赵超,等.中药有效成分抗肝癌作用机制研究进展[J].中国中药杂志,2020,45(14):3395-3406.

[5]籍秀梅,马丽萍.鱼腥草的研究进展[J].河南职工医学院学报,2007,19(1):91-93.

[6]樊宏伟,瞿卫,立彦,等.鱼腥草黄酮提取物对肿瘤细胞的抑制作用[J].中国医院药学杂志,2008,28(7):528-531.

[7]梁明辉.鱼腥草的化学成分与药理作用研究[J].中国医药指南,2019,17(2):153-154.

[8]武营雪,丁倩云,刘静,等.鱼腥草化学成分､药理及质量控制研究进展[J].药物分析杂志,2022,42(1):108-120.

基金资助:广西自然科学基金项目(2023GXNSFAA026154);

文章来源:李华道,林丽桥,梁羽冰,等.鱼腥草对肝癌细胞生物学行为的影响及网络药理学分析[J].中国癌症防治杂志,2024,16(03):277-284.