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上调Cx43蛋白表达增强自杀基因治疗鼻咽癌的旁观者效应

2024-11-18 75 上传者：管理员

摘要：目的:研究上调Cx43基因蛋白表达增强自杀基因治疗鼻咽癌的旁观者效应。方法:构建带Cx43基因的重组质粒,转染鼻咽癌细胞CNE-2和CNE-2/tk,实验分组:Cx43未转染组:不同比例鼻咽癌CNE-2细胞与CNE-2tk细胞混合,Cx43转染组:不同比例鼻咽癌CNE-2-Cx43细胞与CNE-2tk-Cx43细胞混合;对照分组:对照组1:不同比例鼻咽癌CNE-2细胞与CNE-2tk细胞混合;对照组2:不同比例鼻咽癌CNE-2-Cx43细胞与CNE-2tk-Cx43细胞混合。以不同对照组比较Cx43转染组与未转染组细胞存活率的差异。结果:以对照组1作为对照,tk-与tk+细胞的混合比例分别为100∶0,95∶5,90∶10,80∶20,75∶25,50∶50,0∶100时,Cx43未转染组与Cx43转染组细胞存活率分别对应为94.3%∶82.4%,83.2%∶63.5%,73.3%∶51.6%,52.7%∶33.9%,38.2%∶27.6%,17.6%∶16.8%,8.1%∶6.3%。tk-与tk+细胞的混合比例分别为100∶0,95∶5,90∶10,80∶20,75∶25时,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）,其他各组比较,差异无统计学意义（P>0.05）;以对照组1作为Cx43未转染组对照,以对照组2作为Cx43转染组对照,tk-与tk+细胞的混合比例分别为100∶0,95∶5,90∶10,80∶20,75∶25,50∶50,0∶100时,Cx43未转染组与Cx43转染组细胞存活率分别对应为91.8%∶94.7%,82.1%∶71.9%,72.6%∶58.1%,51.6%∶38.7%,35.5%∶29.8%,13.2%∶16.8%,7.6%∶6.3%。tk-与tk+细胞的混合比例分别为95∶5,90∶10,80∶20,75∶25时,两组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,其他各组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:上调鼻咽癌细胞的Cx43和缝隙连接可明显增强自杀基因治疗鼻咽癌旁观者杀伤效应,为鼻咽癌的防治开拓新的方法和思路。

关键词：
Cx43基因蛋白
单纯疱疹病毒胸苷激酶
抗肿瘤治疗
旁观者效应
鼻咽癌
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鼻咽癌在我国南方多见，病理类型以低分化、未分化鳞癌多见，首选治疗以放疗为主。但5年生存率仍不满意。近年来肿瘤生物治疗学发展迅速，基因治疗正成为抗肿瘤治疗新策略[1-2]。缝隙连接是相邻细胞之间特殊的通道蛋白Cxs组成。Cx43与肿瘤联系最为密切。Cx43减少或缺失与多种肿瘤的发生、发展及转移密切相关[3]。上调细胞缝隙连接通讯、促进基因治疗旁观者效应成为探索肿瘤治疗的新热点[4]。本研究经过本院医学伦理委员会同意，针对鼻咽癌细胞Cx43低表达特点，将Cx43基因蛋白转入鼻咽癌细胞上调其缝隙连接通讯水平，通过细胞培养试验及动物模型实验探讨过表达Cx43基因蛋白后对自杀基因治疗鼻咽癌旁观者杀伤效应的增强效果。

1、材料与方法

1.1材料：

逆转录病毒HSV-tk载体转染的鼻咽癌细胞CNE-2/tk及重组质粒pCMV-Cx43cDNA转染的CNE-2-Cx43和CNE-2/tk-Cx43细胞由李宝金博士构建并提供。

1.2方法：

实验分组：Cx43未转染组：不同比例CNE-2细胞与CNE-2tk细胞混合；Cx43转染组：不同比例CNE-2-Cx43细胞与CNE-2tk-Cx43细胞混合，对照分组：对照组1:不同比例鼻咽癌CNE-2细胞与CNE-2tk细胞混合；对照组2:不同比例鼻咽癌CNE-2-Cx43细胞与CNE-2tk-Cx43细胞混合。以不同对照组对照比较Cx43转染组与未转染组细胞存活率的差异。实验组和对照组细胞各接种于细胞培养板，接种密度每孔固定为5×103个。各组tk-与tk+细胞分别按100∶0,95∶5,90∶10,80∶20,75∶25,50∶50,0∶100的比例混合。每组设8个平行孔。接种1 d后，实验组改用含丙氧鸟苷3 ng/ml培养基培养，对照组在无丙氧鸟苷培养基内培养。培养基每隔2天更换。7 d结束后检测细胞存活率。细胞存活率=实验组细胞吸光度/对照组同比例混合细胞吸光度×100%[5]。

2、结果

2.1上调Cx43后对CNE-2生长抑制作用及促进旁观者效应：

以CNE-2/CNE-2tk混合细胞(对照组1)作为空白对照，tk-与tk+细胞的混合比例分别为100∶0,95∶5,90∶10,80∶20,75∶25,50∶50,0∶100时，Cx43未转染组与Cx43转染组细胞存活率分别对应为94.3%∶82.4%,83.2%∶63.5%,73.3%∶51.6%,52.7%∶33.9%,38.2%∶27.6%,17.6%∶16.8%,8.1%∶6.3%;tk-与tk+细胞的混合比例分别为100∶0,95∶5,90∶10,80∶20,75∶25时，两组比较存在显著差异(P<0.05),tk-与tk+细胞的混合比例50∶50,0∶100时，两组比较无显著差异(P>0.05)。

2.2上调Cx43对自杀基因旁观者效应增强结果：

以不含丙氧鸟苷CNE-2/CNE-2tk混合细胞(对照组1)作为Cx43未转染组为对照，以不含丙氧鸟苷CNE-2-Cx43 /CNE-2tk-Cx43混合细胞(对照组2)作为Cx43转染组为对照，tk-与tk+细胞的混合比例分别为100∶0,95∶5,90∶10,80∶20,75∶25,50∶50,0∶100时，Cx43未转染组与Cx43转染组细胞存活率分别对应为92.8%∶94.7%,82.1%∶71.9%,72.6%∶58.1%,51.6%∶38.7%,35.5%∶29.8%,13.2%∶14.8%,7,6%∶6.3%;tk-与tk+细胞的混合比例分别为95∶5,90∶10,80∶20,75∶25时，两组比较存在显著差异(P<0.05),tk-与tk+细胞的混合比例分别为100∶0,50∶50,0∶100时，两组比较无显著差异(P>0.05)。

3、讨论

目前基因治疗应用中，自杀基因HSV-tk/GCV在肿瘤基因治疗中应用最为广泛。其机制是对肿瘤细胞直接杀伤和旁观者效应，旁杀效应机制尚存争议，但是基本达成共识的机制是细胞间GJIC通过介导细胞毒性的三磷酸化GCV在细胞间传播发挥重要作用[6]。鉴于大多数肿瘤细胞存在GJIC缺陷，因此，通过上调肿瘤细胞的GJIC增强旁杀效应有可能正成为肿瘤治疗的新途径[7]。

国内外研究目前在肺癌、胃癌、肝癌、恶性黑色素瘤、胶质瘤、乳腺癌方面取得了一些进展。Ruch[8]指出Cx43在肺癌中可以抑制癌症干细胞(CSCs)的表达同时降低其含量，故若上调Cx43的表达也可以改善肺癌的病情进展；Li等[9]指出Cx43在胃癌组织中的表达比在癌旁正常组织中的表达明显减少，Cx43在胃癌中的表达缺失会造成缝隙连接的数量和门控通道性质发生改变，导致缝隙连接通讯异常；Lonta等[10]证实Cx43在肝细胞癌组织中的表达明显降低且存在分布异常，通过免疫荧光法得出缝隙连接在肝细胞癌的数量减少导致缝隙连接功能的缺失，随着研究Cx43磷酸化在肝细胞癌中作用机制的深入，为肝细胞癌治疗将有可能提供新的方；叶新运[11]发现当神经胶质瘤细胞转染表达Cx43时HSV-TK/GCV的自杀基因显著增强。Tishchenko等[12]发现Cx43突变的小鼠体内，恢复Cx43表达水平可显著抑制乳腺肿瘤向肺脏转移。综上所述，Cx43表达的缺失引起缝隙连接功能异常，加速了肿瘤的进展。在肿瘤的形成和转移过程中鉴于Cx43和缝隙连接的调节作用，Cx43和缝隙连接可能是一种肿瘤治疗的新靶点。通过恢复或上调肿瘤细胞的Cx43和缝隙连接将可能是提高疗效的一个有效途径[13-14]。

有关Cx43和缝隙连接与鼻咽癌关系国内外也有相应研究报道，Zhu等[15]研究鼻咽癌细胞的侵袭迁移能力与蛋白酶活化受体1密切相关，蛋白酶活化受体1激活，Cx43表达下降，肿瘤细胞侵袭迁移能力增加；反之蛋白酶活化受体1被抑制，Cx43表达增加，肿瘤细胞侵袭迁移能力减低，表明Cx43可作为肿瘤抑制基因成为鼻咽癌早期治疗新靶点。罗吉琴等[16]研究鼻咽癌组织中缝隙连接蛋白Cx43的表达与患者临床病理特征及肿瘤侵袭活力的相关性，结果显示Cx43低表达可能与鼻咽癌患者的临床病理特征改变、肿瘤侵袭活力增强有关，并参与了鼻咽癌的发生发展过程；王化修等[17]研究鼻咽癌癌前病变动物模型中Cx43呈低表达。

本研究表明tk+细胞的比例是决定旁杀效应的重要因素。比例为50∶50的tk-∶tk+混合细胞时细胞存活率为13.2%,旁观者效应表现最强。从本实验看出，转染Cx43对旁观者效应在tk+肿瘤细胞占总数细胞的10%～25%时，旁观者效应促进作用最为显著。因此通过恢复或上调鼻咽癌细胞的Cx43和缝隙连接可增强自杀基因治疗鼻咽癌旁观者杀伤效应，有望为鼻咽癌的防治提供新的途径。

参考文献:

[5]赵嘉惠,张华屏,王春芳.MTT法在检测细胞增殖方面的探讨[J].山西医科大学学报,2007,38(3):262-263.

[6]赵希伟,刘倩,滕飞,等.连接蛋白43的磷酸化在恶性肿瘤发生机制中的研究进展[J].河北医药,2007,43(24):3812-3815.

[11]叶新运.Cx43及其磷酸化蛋白在人脑胶质瘤细胞的表达及相关性研究[D].广州:南方医科大学,2015.

[16]罗吉琴,叶永梅,代学华,等.鼻咽癌组织中Cx43､Cx26的表达与患者临床病理特征的相关性分析[J].肿瘤药学,2020,10(5):589-593.

[17]王化修,田道法,吴新正,等.鼻咽癌癌前病变小鼠鼻咽黏膜上皮组织Cx43､Cx32､Cx26的表达变化[J].山东医药,2015,55(2):29-31.

基金资助:江西省教育厅科技计划项目[项目编号:GJJ2201613];江西省卫健委科技计划项目[项目编号:SKJP220229759];

文章来源:曾友根,夏胜岚,张燕红,等.上调Cx43蛋白表达增强自杀基因治疗鼻咽癌的旁观者效应[J].吉林医学,2024,45(11):2609-2612.