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SAA水平及其基因多态性分析在川崎病中的临床价值

2020-12-26 543 上传者：管理员

摘要：目的：探讨血清淀粉样蛋白A(SAA)水平在川崎病(KD)患儿中的变化及临床意义,SAA1rs12218、SAA2rs2468844基因多态性与KD易感性之间的关系。方法：选取90例KD患儿作为KD组,选取同期100例健康儿童作为对照组,利用散射免疫比浊法检测SAA水平;采用基于聚合酶链式反应(PCR)的序列分型方法对两种单核苷酸多态性SAA1rs12218和SAA2rs2468844进行分析。结果：KD组SAA水平较对照组明显升高,经治疗后SAA水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);SAA1rs12218、SAA2rs2468844位点TT、TC、CC基因型分布和T、C等位基因分布在KD组与对照组、KD-CAL组与KD-NCAL组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：SAA水平可能有助于监测KD病程;尚未发现SAA1rs12218、SAA2rs2468844位点多态性与KD及其冠脉损伤的发生存在关联性。

关键词：
SAA
儿科
基因多态性
川崎病
血清淀粉样蛋白A
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川崎病（KD）也称黏膜皮肤淋巴结综合征，其主要临床症状为持续性高热、口腔黏膜炎、结膜充血、手足硬性肿胀、多形性皮疹和非化脓性淋巴结肿大、手足蜕皮等[1]。KD是一种多系统血管炎，可以导致冠状动脉病变[2],KD在低龄儿童中更为常见，大多数的KD发生在5岁以下，男性与女性的比例约为1.5∶1.0[3]。KD的病因尚不明确，随着分子遗传学的发展，许多研究集中于基因多态性与KD之间的关系。血清淀粉样蛋白A(SAA）是一种急性期蛋白和炎症标志物，在急性期早期，免疫系统被激活，由此异常活化的T淋巴细胞释放大量的炎性介质和细胞因子刺激肝脏合成SAA。SAA长期以来被认为是类风湿关节炎临床进展和预后的预测因子，也是冠状动脉疾病、心血管疾病预后和急性冠脉综合征早期死亡的预测因子[4]。在缺血性心肌病患者中，SAA水平明显升高，而扩张型心肌病患者中SAA水平升高程度不及缺血性心肌病患者[5]。近年来关于SAA在心血管疾病中的研究发现，SAA也可能作为大动脉炎的生物标志物[6,7]。本次研究旨在阐述KD中SAA水平变化，以及对SAA基因多态性与KD易感性及KD冠状动脉损伤之间的关联进行研究，了解SAA在KD发病机制中的作用。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2016-2019年在株洲市中心医院住院的90例汉族KD患儿作为KD组，其中男58例，女32例，男女比例为1.8∶1.0，年龄为6月至5岁，平均年龄为2.75岁，所有患儿在采血前没有经过人免疫球蛋白（IVIG）及阿司匹林治疗；均符合KD诊断标准[8]。为进一步探究SAA基因多态性与KD冠状动脉损伤之间的关系，将KD组按照有无冠状动脉损伤分为KD合并冠状动脉损伤（KD-CAL组）和KD无冠状动脉损伤（KD-NCAL组）。冠状动脉损伤的诊断标准：左冠状动脉或右冠状动脉的内腔直径>3mm(5岁以下儿童），>4mm(5岁及以上儿童），或一段冠状动脉内径至少是相邻冠状动脉的1.5倍或冠状腔明显不规则。选取100例健康儿童作为对照组，无心血管疾病及既往无KD病史，其中男63例，女37例，男女比例为1.7∶1.0，年龄为6月至5岁，平均年龄为3.48岁，对照组及KD组性别比例比较，差异无统计学意义（χ2=0.043,P=0.836），具有可比性。

1.2方法

1.2.1SAA检验方法

采用深圳市国赛生物技术有限公司提供的SAA定量试剂盒（散射免疫比浊法）测定SAA水平（>10mg/L为异常），按试剂说明进行操作；KD患儿入院后，在使用IVIG及阿司匹林前后分别空腹采集静脉血2mL，对照组儿童空腹采取静脉血2mL，分次检验。

1.2.2DNA提取和基因多态性检测

应用PromegaDNA提取试剂盒，提取血液DNA，按照说明书进行操作。检测水平和纯度后置于-20℃冰箱保存，选择SAA1基因多态性位点rs12218和SAA2基因多态性位点rs2468844检测，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增基因，使用引物的序列为rs12218上游引物：AGT-GGATGGTAGGAGTGAGTGA，下游引物：TACTTTGTGGTATAGACTGCCTGT。rs2468844上游引物：ATGCCATATCTCAGCTTCTCTGGAC，下游引物：GGAGGAGTGAAAACACTGACCC（上海生工生物工程技术服务有限公司合成）。PCR的反应体系为25μL:T3SuperPCR混合液22μL（北京擎科生物技术公司），上游引物1μL（北京擎科生物技术公司），下游引物1μL（北京擎科生物技术公司），DNA1μg。PCR的反应条件如下，rs12218:98℃预变性2min;98℃变性10s,61℃退火10s,72℃延伸5s,35个循环，72℃终末延伸2min,4℃保存。rs2468844:98℃预变性2min;98℃变性10s,61℃退火10s,72℃延伸5s,35个循环，72℃终末延伸2min,4℃保存。反应在PCR扩增仪（美国AppliedBiosystems公司）上进行。扩增产物送到测序公司（上海铂尚生物技术有限公司）进行基因测序。测序结果在Chromas软件（澳大利亚Technelysium公司）中进行阅读分析。

1.3统计学处理

使用软件SPSS18.0进行数据处理及统计分析，计量资料以表示，组间比较采用独立标本t检验，计数资料以频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，使用1个自由度的χ2检验进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验各基因型频率的遗传平衡性，双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1KD组临床资料

在KD组中，发热90例（100.0%），皮疹68例（75.6%），球结膜充血41例（45.6%），草莓舌69例（76.7%），颈部非化脓性淋巴结肿大70例（77.8%），手足硬肿50例（55.6%），指端脱皮61例（67.8%），肛周脱皮50例（55.6%），冠脉损伤25例（27.8%）。

2.2KD组与对照组SAA水平比较

KD患儿SAA水平治疗前为（434.72±168.50)mg/L，治疗后为（20.23±7.11)mg/L，差异有统计学意义（t=9.548,P<0.01），治疗前KD组与对照组SAA水平[（3.83±2.60)mg/L]比较，差异均有统计学意义（t=9.619,P<0.01）。

2.3SAA基因PCR产物图

SAA1基因rs12218位点的扩增产物片段为525bp,SAA2基因rs2468844位点的扩增产物片段为380bp，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳分离，见图1、2。基因直接测序法测序结果见图3、4。SAA1基因rs12218位点的基因型和等位基因频率在对照组和KD组的分布经Hardy-Weinberg吻合度检测差异无统计学意义（χ2=1.66、5.76,P>0.05）。SAA2基因rs2468844位点的基因型和等位基因频率在对照组和KD组的分布经Hardy-Weinberg吻合度检测差异无统计学意义（χ2=0.15、0.66,P>0.05）。结果与预期一致。

图1SAA1基因位点rs12218PCR产物凝胶电泳

图2SAA2基因位点rs2468844PCR产物凝胶电泳

图3SAA1rs12218位点基因测序图

图4SAA2rs2468844位点基因测序图

2.4SAA1rs12218位点基因型及等位基因分布

SAA1rs12218位点的TT、TC、CC基因型分布与T、C等位基因在KD组和对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。TT、TC、CC基因型分布与T、C等位基因在KD-CAL组与KD-NCAL组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1SAA1rs12218基因型及等位基因分布与KD易感性的关系（n)

2.5SAA2rs2468844位点基因型及等位基因分布

SAA2rs2468844位点的TT、TC、CC基因型分布与T、C等位基因在KD组和对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。TT、TC、CC基因型分布与T、C等位基因在KD-CAL组与KD-NCAL组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2SAA2rs2468844基因型及等位基因分布与KD易感性的关系（n)

3、讨论

KD好发于5岁以内的幼儿，是一种以全身性中、小血管炎为主要病变的急性发热出疹性疾病，是儿童后天性心脏病最常见的病因之一[9]，其发病机制及病因不明。

SAA是一种急性时期蛋白，在机体发生炎症时其水平快速上升，是目前最敏感的炎症标志物之一，近期研究发现SAA水平与冠心病、脑出血等心血管疾病的严重程度及其炎性反应呈正相关[10,11]。高水平的SAA可能通过升高C反应蛋白（CRP）、纤维蛋白原、白细胞介素（IL)-6水平或降低高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平在冠心病中发挥作用[10]。许多炎性因子，包括细胞因子、趋化因子、急性期反应物（如CRP、SAA）在KD中明显升高，提示SAA有可能参与了KD的发生机制[12]。KD患儿SAA、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的改变与其出现血管炎性反应、冠状动脉损伤有关[13]。本研究结果表明，SAA水平在KD患儿急性期明显升高，使用IVIG后水平迅速下降，KD患儿SAA水平在使用IVIG前后均较对照组更高。由此可说明，SAA可能参与了KD的发生过程，SAA作为新的炎症因子，SAA水平在KD治疗前后的变化，提示炎症参与了KD病程，与既往研究中SAA水平的监测有助于监测KD疾病评估疗效这一结论一致[13,14],SAA可能作为诊断KD的早期诊断指标。

KD是一种可能与遗传易感有关的全身性血管炎综合征，目前已有研究发现，家族中既往亲属有KD病史的儿童KD患病率相应增加[15]。SAA可在单核/巨噬细胞、内皮细胞中诱导促炎和促血栓形成介质的表达，并诱导内皮细胞功能障碍，在动脉粥样硬化中SAA有促进炎症的作用[16,17]，炎症早期SAA通过诱导基质金属蛋白酶导致斑块失稳，促使血栓事件的发生；SAA遗传基因多态性与心血管疾病相关，SAA基因位点（SAA1rs12218）突变与冠心病及其预后结局相关[18,19],SAA1rs12218CC基因型是脑梗死的独立危险因素[20];SAA基因多态性（SAA1rs12218及SAA2rs2468844）基因突变在心肌梗死、颈动脉内膜中层厚度（IMT）增厚等疾病中可能起到遗传学标志物的作用[21]，而SAA1rs12218CC基因使汉族冠心病的风险增加[22]。本研究选择SAA1rs12218位点、SAA2rs2468844位点，探讨其多态性与KD及KD冠状动脉损伤的关系。

本研究结果显示，KD患儿SAA1rs12218位点基因型分布与等位基因分布与健康儿童比较，差异无统计学意义（P>0.05),SAA2rs2468844位点基因型分布及等位基因分布与健康儿童相比，差异无统计学意义（P>0.05),KD无冠状动脉损伤患儿SAA1rs12218、SAA2rs2468844位点基因型分布及等位基因频率与KD合并冠状动脉损伤患儿比较，差异无统计学意义（P>0.05）。因此，本研究尚未发现SAA1rs12218、SAA2rs2468844位点与KD及其冠状动脉损伤的发生存在相关性。

4、结论

本研究通过监测SAA水平在KD病程的变化，初步发现SAA水平可能有助于监测KD病程，可能有助于KD的早期诊断。此外，笔者发现SAA基因多态性（SAA1rs12218位点和SAA2rs2468844位点）与KD遗传易感关联性不强，也可能与本研究样本量不够大有关。因此，仍然需要多个中心和大量样本研究，以进一步揭示SAA基因多态性和KD之间的关系。

参考文献：

[5]吕亚辉,李洁,李莉,等.血清淀粉样蛋白A在缺血性及扩张型心肌病患者中的鉴别及临床意义[J].中国医药导刊,2013,15(6):925-927.

[13]杜佳,周霖,蒋瑾瑾.川崎病患者治疗前后血清淀粉样蛋白和炎症因子变化及其相关性分析[J].湖南师范大学学报(医学版),2019,16(2):11-14.

[14]陈灵红,林红霞,杨德华.血清淀粉样蛋白A对川崎病诊断的临床应用价值[J].浙江中西医结合杂志,2017,27(9):770-773.

[17]张璐璐,刘芸,段文冰,等.血清淀粉样蛋白A与冠心病的相关性研究[J].新医学,2019,50(1):11-15.

[18]谢翔,宋长来,吴雪琴,等.SAA遗传多态性与冠心病临床预后的关联研究[J].新疆医科大学学报,2018,41(1):1-5.

张娟,陈颖,易秀英,刘飞,李红,姚永明,纪青.SAA水平及其基因多态性分析在川崎病中的临床研究价值[J].国际检验医学杂志,2020,41(24):2978-2981.