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血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产患者预测价值

2024-07-15 48 上传者：管理员

摘要：目的分析血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产患者的预测价值。方法随机选择2019年1-12月在该院产科病区产检的孕产妇480例，其中450例随访至分娩，将其中40例自发性早产的孕产妇作为早产组，410例足月产孕产妇作为健康组。比较健康组、早产组、早产组不同孕周者的血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化水平。分析健康组、早产组的临床数据，采用Logistic回归分析早产的风险因素，绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产的预测价值。结果与健康组比较，早产组血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度明显增高(P<0.05);与早产组34～<37周妊娠期女性相比，孕周28～<34周妊娠期女性血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度明显增高(P<0.05);与健康组比较，早产组产次≥2次、妊娠期被动吸烟、阴道胎儿纤维连接蛋白(fFN)阳性、家庭平均月收入<1 000元的比例明显增加(P<0.05),宫颈长度明显缩短(P<0.05);Logistic回归分析结果显示，产次≥2次、妊娠期被动吸烟、宫颈长度短、阴道fFN阳性、家庭平均月收入<1 000元、血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度高均是早产的主要风险因素(P<0.05);ROC曲线分析结果表明，血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度预测早产的曲线下面积为0.868(95%CI:0.834～0.898),最佳截断值为51.43%,灵敏度、特异度、准确度分别为82.50%、84.63%、84.44%。结论血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度高对于早产具有一定的临床预测价值。

关键词：
DNA甲基化程度
Wnt4基因
分娩
早产
预测
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早产指在孕28～<37周时分娩。有资料显示，中国的早产率为5%～15%[1]。婴幼儿时期因为身体内各器官生长发育不完善，可引起婴幼儿呼吸窘迫综合征、高胆红素血症、低血糖、低体重和感染性肺炎等严重并发症，是导致婴幼儿和<5岁儿童早逝的主要原因[2]。此外，由于辅助生殖手术的迅速发展、多胎妊娠产妇的增加及国家生育政策的开放等因素，导致高龄产妇、瘢痕子宫再次妊娠，以及在妊娠期合并内外科疾病的孕产妇比例上升，因此早产儿的风险也随之上升。做好对早产高风险孕妇的监测、预防和处置工作，以及降低早产儿的发生率、改善早产新生儿预后对改善人口素质至关重要。有研究者认为，从人类基因组方面分析，早产儿受人类基因组位点中的许多基因影响，同时易受到环境和多种因素的影响，而且存在某些基因易感者[3,4]。Wnt4是WNT配体家族成员，其可能参与调控支持胚胎发育所必需的基质细胞(子宫内膜)的增殖和分化，对子宫内膜的蜕膜及随后的植入和妊娠的建立至关重要，且广泛参与妊娠过程[5]。DNA甲基化是一个动态的表观遗传学变化过程，其对控制哺乳动物细胞生长、调控基因和谱系鉴别等具有重要意义[6,7]。本研究选取40例自发性早产孕产妇及410例足月产孕产妇为研究对象，分析血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产的预测价值。

1、资料与方法

1.1一般资料

随机选择2019年1—12月在本院产科病区产检的孕产妇480例，其中450例随访至分娩，将40例自发性早产的孕产妇设置为早产组，410例足月产孕产妇设置为健康组，根据孕早期B超结果与末次月经时间对孕周进行推算，早产组分娩孕周在28～36+6,健康组分娩孕周在37～41+6。纳入标准：(1)在本院产检，可获取妊娠期血液标本；(2)临床资料完整；(3)精神与意识正常，可正常沟通。排除标准：(1)双胎妊娠；(2)发生妊娠期高血压、妊娠糖尿病等严重妊娠并发症，或妊娠期间合并心脏病等严重妊娠综合征等。本研究在本院医学伦理委员会批准后实施，孕妇及其家人均对研究内容知情接受，并建立了科研知情同意书。

1.2方法

1.2.1甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)测定Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度

于孕产妇孕26周时抽取静脉血5 mL,3 500 r/min离心5 min,取上清液至离心管中。抽提血清中DNA,鉴定纯度。取DNA 4μL与水混合至40μL,添加NaOH溶液(10μL,3 mol/L),37℃孵育10 min,添加对苯二酚(30μL,10 mmol/L)与亚硫酸氢钠(520μL,1.5 mol/L),52℃孵育20 h, DNA纯化试剂盒回收，添加NaOH溶液(50μL,1 mol/L),静置10 min,加入无水乙醇沉淀，3 500 r/min离心10 min,静置10 min,加入去RNA酶水20μL,重悬，存放于-20℃环境中备用。采用MS-PCR测定Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度，总反应体系20μL。Wnt4基因引物，甲基化引物：上游引物序列为5′-CTGAACGTGGGTGCGGCACGTCAC-3′,下游引物序列为5′-CAACACGTGCGTCACGCAACGTGC-3′;非甲基化引物：上游引物序列为5′-GTGCCGCTGCACACGTGCCCGTGA-3′,下游引物序列为5′-GTCTCACGCTGCACCACACCGTTG-3′。扩增产物由2%琼脂糖凝胶电泳，UV系统成像，紫外灯下观察并拍照分析Wnt4基因启动子区的CpG岛甲基化程度。

1.2.2临床资料收集

采集孕妇医学数据，包括年龄、伴侣年龄、妊娠期增重、孕前体质量指数(BMI)、家族病史、是否经产妇、自然流产史、产次、受孕方式，以及有无子宫结构畸形、子宫肌瘤、瘢痕子宫、孕前吸烟、孕前饮酒、妊娠期吸烟、妊娠期被动吸烟、妊娠期饮酒、妊娠期发热、妊娠期接触噪声、妊娠期接触电脑、妊娠期从事重体力工作、妊娠期贫血、妊娠期性行为、维生素D缺乏、前置胎盘、胎盘形状异常、定期产检、胎位异常、脐带异常、羊水异常、阴道炎症、宫内感染和宫颈长度、宫颈内口宽度、阴道胎儿纤维连接蛋白(fFN)阳性、受教育程度、家庭平均月收入等。

1.3统计学处理

采用SPSS19.0统计学软件进行数据处理及统计分析。符合正态分布的计量资料以

表示，组间比较采用t检验；计数资料以频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用多因素Logistics回归分析早产的危险因素，采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产的预测效能。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1健康组、早产组血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度比较

健康组与早产组血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度分别为(42.10±5.34)%、(74.15±8.96)%,两组比较差异有统计学意义(t=33.670,P<0.001)。

2.2早产组不同孕周者血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度比较

孕周28～<34周孕妇与孕周34～<37周孕妇血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度分别为(59.87±7.39)%、(80.65±9.12)%,两组比较差异有统计学意义(t=6.959,P<0.001)。

2.3健康组、早产组临床资料比较

与健康组比较，早产组产次≥2次、妊娠期被动吸烟、阴道fFN阳性、家庭平均月收入<1 000元的比例均明显增加(P<0.05),宫颈长度明显缩短(P<0.05)。见表1。

表1两组临床资料比较[n(%)或

2.4多因素Logistic回归分析早产的危险因素

对早产组、健康组可能影响因素进行赋值，以早产(无=0,有=1)为因变量行多因素Logistic回归分析。结果显示，产次≥2次、妊娠期被动吸烟、宫颈长度短、阴道fFN阳性、家庭平均月收入<1 000元、血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度高均是早产的危险因素(P<0.05)。见表2、3。

表2各因素赋值表

表3多因素Logistic回归分析早产的危险因素

2.5血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产的预测效能

ROC曲线结果显示，血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度预测早产的曲线下面积(AUC)为0.868(95%CI:0.834～0.898),最佳截断值为51.43%,灵敏度、特异度、准确度分别为82.50%(33/40)、84.63%(347/410)、84.44%(380/450)。见图1。

图1血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度预测早产的早产的ROC曲线图

3、讨论

早产的发病机制非常复杂，通常在多因素、多机制的协同作用下发病，大多学者认为其与炎症免疫反应机制、感染因素导致子宫内膜的蜕膜组织多种炎性细胞因子表达增加，以及基因遗传机制有关[8]。有研究结果表明，遗传是妊娠时长及早产的影响因素，自发性早产具有家族聚集特点，且种族差异性及复发性明显，且早产风险可遗传给后代[9,10,11]。随着芯片技术的发展，研究者发现引起早产的重要原因可能是基因异常[10]。本研究结果显示，与健康组比较，早产组血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度升高(P<0.05),且早产组中孕周28～<34周孕妇血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度高于孕周34～<37周孕妇(P<0.05);与健康组比较，早产组产次≥2次、孕期被动吸烟、阴道fFN阳性、家庭平均月收入<1 000元比例均升高(P<0.05),宫颈长度缩短(P<0.05);且经Logistic回归分析，产次≥2次、妊娠期被动吸烟、宫颈长度短、阴道fFN阳性、家庭平均月收入<1 000元、血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度高均是早产的危险因素(P<0.05)。

根据本研究结果和文献复习，提示：(1)更多的产次可能意味着更大的早产风险。KOULLALI等[12]研究结果表明，低体质量与早产治疗时的调整OR值与产次之间存在“数量-效应”的关系，产次≥2次的孕妇早产风险一般是初产孕妇的5倍以上，但具体原因目前还不明确。(2)妊娠期被动吸烟可能意味着更大的早产风险。烟草烟雾是含有主流烟气及侧流烟雾的混合物，被动吸烟者吸入的烟气以侧流烟气居多，这种烟气燃烧不完全，含有的致癌物质较高，相对于主动吸烟更为严重。烟气中的氮氧化物及焦油、尼古丁类等物质可经胎盘进入血液，导致婴幼儿生长发育迟缓、先天畸形和早产[13]。(3)宫颈长度与早产具有密切关联，当宫颈异常成熟，长度过早缩短，提示存在早产风险。REICHER等[14]将宫颈长度<25 mm作为过短的临界点，在孕周<28周时若宫颈长度<25 mm则提示可能面临更大的早产风险。(4)绒毛膜、胎盘、蜕膜及胎儿组织中均有fFN存在，fFN主要存在于胎盘胎膜及子宫连接位置，其是保护羊膜的重要物质。健康孕妇在孕周<37周时的宫颈阴道分泌fFN水平极少，在临产前的机械性破坏及蛋白分解作用下，绒毛膜从子宫壁脱离，fFN渗入羊水与宫颈管中，从而导致其水平增加。(5)家庭收入与早产发生有关，可能与低收入家庭的孕妇营养无法充分保障，生活压力较大，且未能按时产检等有关。(6)自发性早产原因可能涉及胎膜细胞外环境的破坏或细胞坏死。妊娠早期启动主要是由蜕膜细胞的凋亡所导致，当临近生产期，蜕膜细胞凋亡量逐步增多，直到其凋亡总量达到某一阈值，生产期开始。

Wnt信号通路是生命系统中的基本信号通路，可控制胚芽嵌入子宫和维持子宫内的稳态细胞数量，并在月经周期激活雌激素及控制黄体酮水平。在胚胎植入过程中，Wnt4被认为在调节基质细胞蜕膜过程中发挥作用[15]。有研究显示，Wnt4基因可能通过影响子宫内膜而成为早产的一个决定性因素[16]。此外，有研究提示，Wnt4信号通路是调节突触连接的关键通路之一，Wnt4参与脊椎动物神经肌肉接头的形成，直接影响突触后分化[17]。而早产是各种因素导致子宫平滑肌收缩的结果，提示Wnt4有可能参与子宫平滑肌收缩而引发早产。全基因组关联研究中提到，AGTR2、Wnt4、EBF1、EEFSEC、ADCY5和RAP2C基因座的变异与妊娠时长相关[18]。综合分析早产发病机制的复杂性和Wnt4生物学多样性，提示Wnt4基因与早产可能存在一定的联系。此外，本研究结果显示，血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度预测早产的AUC为0.868(95%CI:0.834～0.898),最佳截断值为51.43%,特异度、灵敏度、准确度分别为84.63%、82.50%、84.44%,提示血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产有较高的预测价值。因此，临床产检需加强该指标的检测，预测孕妇早产风险，及时采取干预措施，降低早产的发生率，保证母婴安全。

综上所述，血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度高对于早产具有一定的预测价值。

参考文献:

[1]孔琳,陈昭霞,覃钰芹,等.2017-2019年广西壮族自治区早产发生率及相关因素分析[J].中华医学杂志,2020,100(42):3338-3341.

[4]庞一鸣,王佳帽,刘念,等.孕妇基因多态性和自发性早产发生风险的关联性研究[J].中国生育健康杂志,2020,31(2):132-136.

[6]赵若琳,贾晨琪,李艾聪,等.哺乳动物基因组印记的擦除,建立和维持机理[J].中国细胞生物学学报,2020,42(3):512-518.

基金资助:湖北省孝感市科技计划科研项目(XGKJ2019010022);

文章来源:邱兰,熊琼英,蔡大芬.血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产患者预测价值分析[J].国际检验医学杂志,2024,45(13):1580-1585.