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甘草附子汤对风寒湿痹型痛风性关节炎小鼠的治疗作用及机制

2024-07-15 171 上传者：管理员

摘要：目的探讨甘草附子汤(Licorice aconite decoction, LA)对风寒湿痹型痛风性关节炎小鼠的治疗作用及机制。方法将40只ICR小鼠随机分为空白组(CON)、模型组(MOD)、非布司他组(Febuxostat, FBX,8 mg/(kg·d))和甘草附子汤组(LA,6.4 g/(kg·d))。同时建立风寒湿痹型痛风性关节炎小鼠模型，持续2周。观察小鼠关节肿胀情况；检测小鼠血清尿酸(uric acid, UA)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平；检测肝脏中黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase, XOD)水平；采用ELISA试剂盒检测血清肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)水平；HE染色观察小鼠踝关节组织病理学情况；蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠踝关节组织中核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、蛋白激酶B(threonine protein kinase, AKT)、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平。结果 FBX组、LA组小鼠关节肿胀度均有不同程度的显著降低(P<0.05)。与MOD组比较，FBX组和LA组血清UA浓度、MDA、XOD、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05),CAT、SOD水平显著升高(P<0.05)。HE染色结果显示，与CON组比较，MOD组小鼠关节炎性细胞浸润明显；与MOD组比较，FBX组和LA组炎性细胞浸润减轻，细胞形态相对光滑完整。Western blot结果显示，与MOD组比较，FBX组和LA组关节组织中NF-κB、AKT、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论甘草附子汤对风寒湿痹型痛风性关节炎小鼠具有保护作用，其机制可能是通过改善模型小鼠体内氧化应激状态，抑制NF-κB/AKT信号通路激活，下调下游炎症因子TNF-α、IL-1β表达，达到减轻小鼠关节炎症的效果。

关键词：
LA
氧化应激
炎症因子
甘草附子汤
风寒湿痹型痛风性关节炎
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痛风性关节炎是由于体内嘌呤代谢过程紊乱，尿酸排泄减少导致的尿酸含量过高，使尿酸结晶沉积在关节内而引发的关节炎症，可并发肾功能损害、关节破坏变形，并形成痛风石，还常伴发高血压、高血脂等疾病[1,2]。风寒湿痹型痛风性关节炎是痛风的一种，主要由于气血闭塞不畅、代谢紊乱、风寒湿邪进入体内、经络阻塞不通所致[3]。临床治疗常用的传统药物(秋水仙碱、糖皮质激素等)不良反应太大，严重者会导致肝肾脏损害等问题，而中药的毒副作用小，遵循配伍规律的中药处方能起到显著的治疗效果，因此，应用安全、有效的中药制剂对于抗痛风方面的研究具有重要意义[4,5]。

甘草附子汤(Licorice aconite decoction, LA)记载于《金匮要略》,由甘草、附子、白术和桂枝组成。附子温阳散寒，白术健脾祛湿，桂枝温经通脉、发汗解肌，甘草和中缓急，四药合用暖肌补中，益精气，内外兼调，寒湿消散，则痹证可除[6,7]。研究[8]发现，甘草附子汤治疗关节炎有较好的疗效，但对于风寒湿痹型痛风性关节炎的作用还鲜有报道。因此，本试验通过建立风寒湿痹型痛风性关节炎小鼠模型，观察甘草附子汤对模型小鼠的作用，并初步探讨其作用机制，为后续研究提供理论依据。

1、材料

1.1 动物

SPF级ICR小鼠(长春亿斯实验动物技术有限责任公司，批号：SCXK(吉)-2022-0002),雄性40只，体质量(20.0±2.0)g, 于动物室饲养，饮食自由。本试验经北华大学动物伦理委员会审核批准。

1.2 药品与试剂

甘草附子汤中的甘草、附子、白术、桂枝，保康中药饮片加工公司；非布司他，国药准字H20213719,南京海纳制药有限公司；UA、MDA、CAT、SOD、XOD检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β检测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；BCA试剂盒、5×SDS PAGE蛋白上样缓冲液，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；羧甲基纤维素钠，美国Sigma公司；次黄嘌呤、氧嗪酸钾，上海瑞永生物科技有限公司；预染蛋白Marker, 武汉赛维尔生物公司；β-actin、NF-κB、Akt、TNF-α、IL-1β抗体、山羊抗兔IgG,美国ABclonal公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器

5430R低温高速离心机，美国Eppendorf公司；UV-2550紫外可见光分光计，上海岛津国际贸易有限公司；InfiniteM200全波段酶标仪，瑞士Tecan公司；游标卡尺，上海首丰精密仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；电泳仪，美国Bio-Rad公司；Chemi 910全自动成像仪，北京赛智创业科技有限公司。

2、方法

2.1 甘草附子汤制备

称取甘草12 g, 附子24 g, 桂枝24 g, 白术30 g, 按照料液比(mV)110的比例加入蒸馏水浸泡0.5 h, 煮沸后文火煎煮提取两次，0.5 h/次，合并两次药液，用蒸发器将药液浓缩至2 g/mL,并于4 ℃保存备用，用时稀释[9]。

2.2 动物模型建立及给药

取40只ICR健康小鼠随机分为4组：空白对照组(CON)、模型对照组(MOD)、非布司他阳性药对照组(FBX)和甘草附子汤组(LA)。采用预防性给药方式，每组给药剂量为FBX组8 mg/(kg·d),LA组6.4 mg/(kg·d),CON组给予等量羧甲基纤维素钠，连续灌胃给药2周。同时，除CON组外，其余各组灌胃给予次黄嘌呤和氧嗪酸钾，剂量均为500 mg/(kg·d),2 h后将小鼠置于冰水中1 h刺激关节，水没过小鼠腿部并伴以3挡风力，之后将小鼠饲养于潮湿阴冷环境中[10]。

2.3 小鼠关节肿胀度

在第3、6、9、12、15天观察小鼠关节肿胀程度，在小鼠踝关节处标记测量点并通过游标卡尺测量直径，计算踝关节肿胀度。踝关节肿胀度=[(当前测量关节直径(mm)-初始测量直径(mm))/初始测量直径(mm)]×100%。

2.4 血清生化指标及肝脏XOD含量测定

取小鼠眼球血液，静置20 min后，按试剂盒说明书操作，经过4 ℃、3 000 r/min离心15 min。各组小鼠血清中UA、MDA、CAT、SOD、TNF-α、IL-1β含量检测按照试剂盒说明书进行。

称取适量肝组织，加入0.9%生理盐水制成10%肝组织匀浆液，经过4 ℃、3 000 r/min离心10 min, 取上清液，检测肝组织中蛋白浓度，按照试剂盒操作方法测定XOD含量。

2.5 踝关节病理学检查

踝关节组织病理切片制备：取灌注后的小鼠踝关节滑膜组织，固定于4%的多聚甲醛；利用乙醇梯度脱水，EDTA脱钙，石蜡包埋；然后进行切片处理，参考HE染色方法；显微镜下观察小鼠关节组织病理变化。

2.6 Western blot法检测关节组织中蛋白表达水平

取小鼠的踝关节滑膜组织，加入RIPA裂解液、磷酸酶抑制剂，匀浆处理后冰上裂解1 h; 经过4 ℃、12 000 r/min离心10 min, 取上清液，检测关节组织中蛋白浓度；用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白，在冰水中将蛋白转移到PVDF膜上，封闭液封闭2 h; 洗膜后加入一抗β-actin(150 000)、NF-κB、Akt、TNF-α、IL-1β(11 000),4 ℃孵育过夜；TBS-T 洗膜15 min×3次，加入二抗(12 000),室温孵育1 h; TBS-T洗膜15 min×3次，加入显影液在成像仪中采集图像。Image J软件分析处理蛋白条带，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比表示蛋白表达水平。

2.7 统计学分析

应用GraphPad Prism 8.0对数据进行Tukey多重比较分析及绘制图形。各组试验数据以均数±标准差

表示，样品数以n表示。P<0.05为差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 小鼠关节踝肿胀情况

本研究结果显示，MOD组小鼠踝关节肿胀度显著高于CON组(P<0.05),且程度不断增加，说明模型建立成功；与MOD组比较，FBX和LA组小鼠的踝关节肿胀程度均有不同程度降低(P<0.05),见表1。

3.2 LA对小鼠血清UA、MDA水平的影响

本研究结果显示，与CON组比较，MOD组小鼠血清UA、MDA水平显著升高(P<0.05);与MOD组比较，FBX组和LA组小鼠UA、MDA水平均显著下降(P<0.05),见图1。

3.3 LA对小鼠血清CAT、SOD活性的影响

本研究结果显示，与CON组比较，MOD组小鼠血清CAT、SOD水平显著降低(P<0.05);与MOD组比较，FBX组和LA组小鼠CAT、SOD水平显著升高(P<0.05),见图2。

表1 小鼠关节肿胀度

图1 LA对小鼠血清UA、MDA水平的影响

图2 LA对小鼠血清CAT、SOD活性的影响

3.4 LA对小鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影响

本研究结果显示，与CON组比较，MOD组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平显著升高(P<0.05);与MOD组比较，FBX组和LA组小鼠TNF-α、IL-1β水平显著降低(P<0.05),见图3。

图3 LA对小鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影响

3.5 LA对小鼠肝脏XOD含量的影响

本研究结果显示，与CON组比较，MOD组小鼠肝脏XOD水平显著增高(P<0.05);与MOD比较，FBX组和LA组小鼠肝脏XOD水平显著降低(P<0.05),见图4。

3.6 踝关节病理学形态观察

踝关节组织病理形态显示，CON组小鼠关节组织相对完整，滑膜细胞光滑，无增生及炎症发生；MOD组小鼠踝关节滑膜组织有增生情况，炎性细胞明显浸润，部分区域染色加深，组织受损，出现水肿、坏死；给予药物治疗后，两组症状均有不同程度改善，炎性细胞浸润减轻，细胞形态相对光滑完整，见图5。

图4 LA对小鼠肝脏XOD含量的影响

3.7 LA对小鼠踝关节组织中蛋白表达水平的影响

本研究结果显示，与CON组比较，MOD组中小鼠NF-κB、AKT、TNF-α、IL-1β蛋白表达显著升高(P<0.05);与MOD比较，FBX组和LA组小鼠NF-κB、AKT、TNF-α、IL-1β蛋白表达显著降低(P<0.05),见图6。

图5 关节病理形态(200×)

图6 小鼠踝关节组织中NF-κB、AKT、TNF-α、IL-1β蛋白表达

4、讨论

风寒湿痹型痛风性关节炎在中医上属于“痹症”范畴，多为风寒湿三邪入体导致的气血闭塞、脾肾虚弱，经络瘀阻关节，因此，应以祛湿除痹、通络止痛的治疗方法为主[11]。

本研究中采用次黄嘌呤和氧嗪酸钾灌胃联合冷水、风力刺激关节的方法建立风寒湿痹型痛风性关节炎模型，通过增加尿酸合成的前体物质次黄嘌呤和尿酸氧化酶抑制剂氧嗪酸钾的水平，可以短时间内引起小鼠尿酸升高，风寒湿的刺激促使尿酸钠晶体留驻于关节及肌肉，无法及时排出，进而导致关节炎症[12,13]。本研究结果提示，模型组小鼠关节明显肿胀、增生，有病理性损伤，并且尿酸水平显著升高(P<0.05),说明风寒湿痹型痛风性关节炎小鼠模型建立成功。给予甘草附子汤药物治疗后，模型组小鼠的关节肿胀程度明显降低，UA水平显著降低(P<0.05),说明甘草附子汤能有效降低小鼠血清中UA的水平，改善小鼠关节肿胀程度。

风寒湿痹导致的气血不通会造成小鼠缺氧，从而诱发机体产生大量自由基，导致活性氧(ROS)在体内蓄积，使小鼠持续处于氧化应激状态，造成组织或细胞损伤，引起脂质氧化产物MDA水平升高、XOD活化，并抑制抗氧化酶CAT、SOD的表达[14]。XOD活化也可引起尿酸代谢紊乱，催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，将黄嘌呤氧化成尿酸[15]。因此，清除ROS、提高机体抗氧化能力是治疗风寒湿痹型痛风性关节炎的关键步骤之一。本研究中，给药后的模型小鼠血清中MDA、XOD水平降低，CAT、SOD的活性增加(P<0.05),说明甘草附子汤能够改善痛风性关节炎小鼠的氧化应激状态。

此外，痛风性关节炎小鼠的氧化应激状态及体内过高的尿酸水平刺激血液及关节腔中巨噬细胞分泌，并释放大量炎症因子，产生关节滑膜炎症浸润，引起局部肿胀、疼痛[16]。NF-κB通常以p65/p50二聚体的形式存在，当细胞受到细胞因子、缺氧、中毒等刺激时，磷酸化的NF-κB p65/p50被激活释放，进入细胞核以调节下游基因转录，参与炎症反应，促进TNF-α、IL-1β等炎症因子过表达[17,18]。AKT是PI3K下游的靶蛋白，在受到外界刺激时，磷酸酶被激活，进而通过下游因子调节细胞增殖与凋亡[19]。而活化的AKT通过增强炎症因子表达，导致NF-κB活化，并转入到细胞核内调控转录，刺激 TNF-α、IL-1β等炎症因子过表达，而过量的炎症因子又会刺激AKT激活[20]。本研究结果提示，给予药物干预后，小鼠血清及关节滑膜组织中TNF-α、IL-1β蛋白表达水平均显著降低，滑膜组织中NF-κB、AKT蛋白表达水平降低(P<0.05),表明甘草附子汤可以抑制NF-κB/AKT信号通路激活，并下调下游炎症因子TNF-α、IL-1β表达，进而减轻小鼠关节炎症。

综上所述，甘草附子汤可以通过改善模型小鼠体内氧化应激状态而减轻炎症，达到治疗风寒湿痹型痛风性关节炎的目的。

参考文献:

[3]文清华,文洪博,蒋祖红,等.甘草附子汤加减治疗对风寒湿阻证类风湿关节炎患者中医临床症状及血清基质金属蛋白酶3､骨保护素和核因子-κB受体活化因子配体水平的影响[J].中医临床研究,2023,15(8):116-120.

[7]张永健,朱晓亮,曹亮,等.薏苡仁汤加味联合针刺对高尿酸血症伴痛风患者(风寒湿痹型)体液免疫､微炎状态和血清DKK1､PICP､RANKL水平影响[J].辽宁中医药大学学报,2023,25(11):33-36.

[12]赵晓峰,刘签兴,姜泉.路志正从脾肾论治痛风经验总结[J].北京中医药,2021,40(10):1092-1094.

[19]刘宾,程传浩,张延武,等.经典名方甘草附子汤治疗骨关节病的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2024,30(5):282-288.

基金资助:吉林省科技攻关计划项目(2023C029-1);

文章来源:刘小瑜,安丽萍,王曼力,等.甘草附子汤对风寒湿痹型痛风性关节炎小鼠的治疗作用及机制[J].北华大学学报(自然科学版),2024,25(05):609-614.