动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是导致心脑血管疾病的重要病理基础之一,以血中脂质在动脉内膜沉积,引起慢性炎症导致粥样斑块形成为病变特征[1]。 研究表明,肠道菌群与胆汁酸代谢关系失衡与AS发生发展密切相关,可通过介导胆固醇代谢和全身炎症影响脂质稳态和免疫代谢[2-3]。 痰瘀同治优化方是基于临床治疗胸痹的有效经验方痰瘀同治方经优化所得。 前期研究证实,痰瘀同治方可通过调节血脂、减轻炎症和抑制内膜斑块形成延缓AS进展[4-5]。 为进一步优化该复方的组方配比,课题组采用群体协同算法和君臣佐使配伍加权理论方法,并通过动物实验进行验证,得到痰瘀同治优化方[6]。 然而,该方能否通过调节肠道菌群及胆汁酸代谢治疗AS尚不明确。 本研究从肠道菌群与胆汁酸代谢的角度探讨痰瘀同治优化方对高脂饮食诱导的AS小鼠的影响,以期为该方的后续研究和应用提供实验依据。 本实验经过中国中医科学院医学实验中 心 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 批 准,批 准 号:ERCCACMS21-2106-11。

1、材料

1. 1动物

28只SPF级雄性ApoE-/ -小鼠,体质量(20±2)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2021-0011,饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所动物房,室温(22±2)℃,湿度45% ~ 55%,12 h / 12 h明暗交替,小鼠自由摄食水。 小鼠基础维持饲料(AIN-93M)以及高脂饲料(D12108C)均购自小黍有泰(北京)生物科技有限公司。

1. 2主要药物与试剂

痰瘀同治优化方由人参、瓜蒌、薤白、半夏、川芎、赤芍6味药组成,药材饮片均购自北京同仁堂(亳州)饮片责任公司,符合2020版《中华人民共和国药典》相关规定。 本药剂采用水煎法制备,将所有药材加入纯水浸泡1 h,煎煮30 min收集药液,后加水复煎30 min,合并2次药液,浓缩后备用。甘油三酯(TG,货号:A111-1-1)、总胆固醇(TC,货号:A110-1-1)、低密度脂蛋白胆固醇( LDL-C,货号:A113-1-1)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C,货号:A112-1-1)检测试剂盒均购自中国南京建成生物工程研究所;改良油红O染色试剂盒(货号:G1261),北京索莱宝科技有限公司;小鼠白介素( IL)-1βELISA试剂盒(货号:KE10003)、小鼠肿瘤坏死因子(TNF)-αELISA试剂盒(货号:KE10002)购自武汉三鹰 生 物 技 术 有 限 公 司; UDCA-d4 (货 号: IR15342),美国IsoSciences公司。

1. 3主要仪器

全自动酶标仪(型号: Synergy H1),美国BioTek公司;冷冻切片机(型号:CryoStar NX70),美国Thermo Fisher Scientific公司;三重四级杆液质联用仪(型号:Waters ACQUITY UPLC+Xevo TQ-S),美国Waters Corp公 司;超 微 量 分 光 光 度 计(型 号:NanoDrop 2000),美国Thermo Fisher Scientific公司;基因测序仪(型号: Illumina NovaSeq 6000),美国Illumina公司。

2、方法

2. 1分组与干预方法

28只ApoE-/ -小鼠适应性饲养1周后随机分为对照组,模型组,痰瘀同治优化方低、高剂量组,每组7只。 对照组予基础饲料饲养,其余3组均采用高脂饲料饲养12周构建AS模型。 自第8周起,对照组和模型组予等体积纯水灌胃,痰瘀同治优化方低、高剂量组灌胃方剂水煎液剂量分别为6. 5 g / kg、13 g / kg,每日1次,连续4周。

2. 2取材

末次给药后12 h,小鼠禁食不禁水,三溴乙醇(200 mg / kg)腹腔注射麻醉,取血后室温静置3 h,离心取上层血清-80℃保存。 体视显微镜下取小鼠整根主动脉(自升主动脉至髂主动脉分支) 4%多聚甲醛固定或液氮速冻后-80℃ 保存。 采用无菌器械和冻存管收集小 鼠 肠 道 内 粪 便,液 氮 速 冻 后-80℃ 保存。

2. 3指标检测

2. 3. 1血清脂质水平检测

采用甘油磷酸氧化酶/过氧化物酶法检测血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平,根据试剂盒说明书操作。

2. 3. 2主动脉粥样硬化病变评价

剥离小鼠心脏连接主动脉处,0. 9%氯化钠溶液冲洗后,干冰上OCT包埋,固定于样本台,以10μm厚度从主动脉开口向心尖方向进行连续切片,直至主动脉瓣膜出现。 取瓣膜完整的切片进行HE染色和油红O染色,显微镜下观察组织病变,采用Image J2对斑块面积进行定量分析。 斑块面积占比= (斑块面积/血管面积)×100%。

2. 3. 3血清炎症因子水平检测

根据ELISA试剂盒说明书检测各组小鼠血清炎症因子IL-1β、TNF-α 水平。

2. 3. 4粪便16S rRNA多样性测序

提取粪便DNA,微量紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及纯度。 以提取的基因组DNA为模板,使用带Barcode的特异引物和Takara Ex Taq高保真酶进行细菌16S rRNA基因的PCR扩增。 采用通用引物343F ( 5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’)和798R( 5’-AGGGTATCTAATCCT-3’)或515F ( 5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和907R ( 5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)扩增16S rRNA基因的V3-V4(或V4-V5)变区,用于细菌多样性分析。PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测,经磁珠纯化后作为二轮PCR模板并进行二轮扩增,再次经磁珠纯化后,将二轮产物进行Qubit定量,然后调整浓度进行测序。 使用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行测序,并生成250 bp双端reads,测序由上海欧易生物技术有限公司进行。

2. 3. 5靶向代谢组学检测血清胆汁酸含量样本

处 理:取80μL血 清,加 入 含 内 标 化 合 物(UDCA-d,45 ng / mL)的20倍甲醇提取,涡旋混合物1 min。 离心,取上清。 色谱条件:BEH C18色谱柱(1. 7μm,2. 1 mm×100 mm),柱 温40℃;进 样 量1μL;流动相A为0. 1%甲酸水溶液,流动相B为0. 1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脱(0~13 min,85% ~30%A,流速0. 4 mL / min; 13 ~ 15 min, 5% A,流速0. 4 mL / min;15~17 min,85%A,流速0. 4 mL / min)。质谱条件:负离子模式;多反应检测(MRM)模式;ESI-MS / MS参数如下:毛细管电压为2. 5 kV,脱溶剂温度为400℃,脱溶剂气体流量为800 L / h(N2,纯度99. 9%)。 以0. 1 mL / min的流速将氩气(99.999%)作 为 碰 撞 气 体 引 入 碰 撞 室。 数 据 分 析:Waters TargetLynx软件用于数据采集和峰处理。

2. 4统计学方法

运用SPSS Statistics 27. 0软件对实验数据进行统计分析,结果以均值±标准差( x±s)描述,多组间比较采用单因素方差分析。P<0. 05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3. 1各组小鼠血脂水平

与对照组比较,模型组小鼠TG、TC和LDL-C水平显著上升(P<0. 05),HDL-C水平显著下降(P<0. 05),与模型组比较,痰瘀同治优化方低、高剂量组小鼠TG、TC水平显著下降(P<0. 05),痰瘀同治优化方高剂量组小鼠LDL-C水平显著下降( P <0. 01),见表1。

表1小鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平

3. 2各组小鼠主动脉斑块病变情况

HE染色和油红O染色结果显示,与对照组比较,模型组小鼠主动脉内膜增厚,细胞排列紊乱,可见炎性细胞浸润,脂质沉积增加,斑块面积显著增大。 与模型组比较,痰瘀同治优化方低、高剂量组小鼠主动脉内膜增厚有所改善,斑块面积显著减小,见图1。

图1小鼠主动脉斑块病变情况

3. 3各组小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平

与对照组比较,模型组小鼠血清IL-1β 和TNF-α表达显著增加(P<0. 01)。 与模型组比较,痰瘀同治优化方低、高剂量组小鼠血清IL-1β 和TNF-α 表达显著降低(P<0. 01),见表2。

表2小鼠血清IL-1β 和TNF-α 表达水平

3. 4各组小鼠肠道菌群变化

α 多样性分析显示,与对照组比较,模型组小鼠肠道菌群Shannon指数和Simpson指数显著下降(P<0. 05);与模型组比较,痰瘀同治优化方高剂量组Shannon指数和Simpson指数均显著回调( P <0. 01)。 β 多样性分析显示,与对照组比较,模型组小鼠肠道菌群分布产生显著偏移,与模型组相比,痰瘀同治优化方高剂量组小鼠肠道菌群分布更趋近正常,见图2。在门 水 平 层 面,小 鼠 肠 道 微 生 物 群 主 要 由Firmicutes,Bacteroidota,Proteobacteria和Actinobacteriota等组成,与对照组比较,模型组Firmicutes丰度显著上升( P < 0. 01), Bacteroidota丰度显著下降( P <0. 01),Firmicutes/ Bacteroidota比值显著升高( P <0. 01);经痰瘀同治优化方干预后,小鼠Firmicutes丰度显著下降(P<0. 01),Bacteroidota丰度显著上升(P<0. 01),Firmicutes/ Bacteroidota比值显著下降(P<0. 01)。在属水平层面,小鼠肠道微生物群共检出442种菌 属,主 要 由Muribaculaceae, Lactobacillus,Escherichia-Shigella,Prevotella,Faecalibacterium等组成,差异菌属共96种,其中前10项差异菌属分别为Muribaculaceae, Lactobacillus, Escherichia-Shigella,Prevotella,Faecalibacterium,Bacteroides,Muribaculum,Ileibacterium,Bifidobacterium和Desulfovibrio,与对照组 比 较,模 型 组 小 鼠 肠 道Escherichia-Shigella,Prevotella,Faecalibacterium,Bacteroides,Ileibacterium,Bifidobacterium丰 度 显 著 上 升( P < 0. 05 ),Muribaculaceae,Lactobacillus,Muribaculum丰度显著下 降( P < 0. 01);经 痰 瘀 同 治 优 化 方 治 疗 后,Escherichia-Shigella, Prevotella, Faecalibacterium,Bacteroides,Ileibacterium,Bifidobacterium丰度显著下降(P<0. 05),Muribaculaceae,Lactobacillus丰度显著回升(P<0. 05),见图3。

图2各组小鼠肠道菌群 α、β 多样性分析

图3各组小鼠肠道菌群组成及代表差异菌属

在线性判别分析(LEfSe)中,将LDA≥4且P<0. 05的物种判定为差异菌群。 在对照组、模型组和痰瘀同治优化方组中分别筛选出4、5、25个优势菌群,其中对照组的主要差异菌群为Muribaculum和Lactobacillus,模型组的主要差异菌群是Muribaculaceae,Bacteroidia,而痰瘀同治优化方组小鼠则以Firmicutes,Clostridia,Proteobacteria,Gammaproteobacteria,Oscillospirales等为主要差异菌群,见图4。

3. 5各组小鼠血清胆汁酸水平

在小鼠血清中共检测并定量了 α-鼠胆酸(αMCA)、β-鼠胆酸(β-MCA)、胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、去氧胆酸(DCA)、石胆酸( LCA)、猪去氧胆酸( HDCA)、牛磺-α-鼠胆酸(TαMCA)、牛磺-β-鼠胆酸( TβMCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸( TCDCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)、牛磺石胆酸( TLCA)、 牛磺猪去氧胆酸(THDCA)和牛磺熊去氧胆酸( TUDCA)共16种胆汁酸,与对照组比较,模型组小鼠血清中初级胆汁酸β-MCA、CDCA、UDCA、TαMCA、TβMCA、TCDCA水平显著升高( P < 0. 01), TCA水平显著下降( P <0. 05),次级胆汁酸LCA水平显著升高(P<0. 01),经痰瘀同治优化方干预后,小鼠血清初级胆汁酸CDCA、UDCA、TβMCA水平显著降低( P < 0. 01),TCA水平显著上升(P<0. 05),次级胆汁酸LCA水平显著降低(P<0. 01),见图5。

图5各组小鼠血清胆汁酸相对水平

3. 6肠道菌群与血清胆汁酸关联性分析

为探索肠道菌群与血清胆汁酸代谢之间的潜在联系,本研究通过计算前10个差异菌属和血清胆汁酸 的Spearman相 关 性 系 数,结 果 显 示, DCA与Escherichia-Shigella, Prevotella, Faecalibacterium,Bacteroides,Bifidobacterium呈显著正相关(P<0. 05),与Muribaculum呈显著负相关(P < 0. 01),TCA与Prevotella,Faecalibacterium和Bacteroides呈显著正相 关( P < 0. 05 ), LCA与Muribaculaceae和Desulfovibrio呈显著正相关(P<0. 05),Muribaculum主要与次级胆汁酸呈显著负相关(P<0. 01),见图6。

图6小鼠血清胆汁酸和肠道差异菌群的关联性分析

4、讨论

根据AS的发病机制及病理特点,中医认为痰浊、瘀血是AS发生与发展的关键,痰瘀互结、损伤脉道是AS的重要病机[7]。 因而,痰瘀同治法是临床治疗AS的常用治法。 痰瘀同治优化方基于痰瘀病机理论,治以祛痰化瘀,由人参、瓜蒌、薤白、半夏、赤芍、川芎组方而成,方中瓜蒌、薤白、半夏豁痰开胸,人参温补心阳、通阳散结,赤芍、川芎活血祛瘀,诸药合用共奏活血化痰,通阳宣痹之效[8]。AS发病主要归因于脂代谢异常、炎症反应及血管内皮损伤等,现代研究认为脂质及炎性介质为“痰”“瘀”生成的物质基础[9]。 本研究采用高脂饮食饲喂ApoE-/ -小鼠12周建立AS动物模型,与对照组比较,模型组小鼠血清TC、TG和LDL-C水平显著上升,HDL-C水平显著下降,血清炎症因子TNF-α、IL-1β 显著上升,病理结果显示,模型组小鼠主动脉根部明显出现脂质沉积,斑块面积占比大幅上升,伴随大量炎性细胞浸润。 然而,经痰瘀同治优化方干预后,模型小鼠血清TC、TG和LDL-C水平显著下降,血清炎症因子TNF-α、IL-1β 水平明显下降,其主动脉根部病变部位脂质沉积减少,斑块面积占比显著下降,提示痰瘀同治优化方能够有效调节血脂及全身炎症水平,达到化痰降浊,祛瘀通脉的目的,从而抑制AS进展。近年来研究发现,肠道菌群失调和胆汁酸代谢是维护机体脂质稳态的重要因素,二者失衡与AS病理进程密切相关[10]。

一方面,肠道菌群可通过调节机体初级胆汁酸的合成和代谢,参与胆固醇代谢和斑块形成,促进AS发生发展[11];另一方面,胆汁酸作为重要的信号分子调节宿主脂代谢,其代谢异常亦可造成肠道菌群紊乱,从而引发AS[12]。肠道微生物群是维持人体健康和新陈代谢的重要参与者,其对AS的促进作用通常被认为是由致病性和非致病性微生物之间的不平衡所致[13]。 临床研究表明,与健康对照者相比,有动脉粥样硬化性心脏 病 的 患 者 肠 道 菌 群 组 成 具 有 显 著 差 异,Firmicutes/ Bacteroidota比值失调更是与高脂饮食诱导的肥胖密切相关[14]。 作为常见的益生菌菌株,乳杆菌属Lactobacillus与AS病变及急性冠脉综合征风险呈负相关,能够通过改善高脂血症和肝功能损伤抑制AS进一步发展[15-16],Muribaculaceae (又名S24-7)丰度与机体脂质和碳水化合物代谢密切相关,对于抵抗高脂饮食诱导的肥胖具有重要作用,并且能够改善肠道屏障功能[17-18]。

致病菌属大肠埃氏菌属-志贺氏菌属Escherichia-Shigella和普雷沃氏菌Prevotella则被报道可促进AS发展。EscherichiaShigella中 含 有 胆 碱 裂 解 酶CutC / D、CntA/ B和YeaW/ X,对三甲胺(TMA)生成具有促进作用,可通过增 加 循 环 氧 化 三 甲 胺( TMAO)的 水 平 诱 导AS[19],Prevotella则与慢性炎症易感性和脂肪积累密切相关,长期单一定植该菌能够促进高脂饮食诱导的ApoE-/ -小鼠动脉斑块形成[20-21]。 在本研究中,模型组小鼠肠道Escherichia-Shigella和Prevotella丰度显著上升,Muribaculaceae和Lactobacillus丰度显著下降,Firmicutes/ Bacteroidota比值显著上升,痰瘀同治 优 化 方 可 显 著 抑 制 小 鼠 肠 道EscherichiaShigella和Prevotella丰度,增加了Muribaculaceae和Lactobacillus丰 度,降 低Firmicutes/ Bacteroidota比值,提示痰瘀同治优化方对高脂饮食诱导的肠道菌群紊乱具有调节作用,可以增加益生菌丰度并抑制有害菌的增长。胆汁酸是宿主和肠道菌群协同代谢的关键内源性信号分子,在肠道脂质吸收和机体代谢调节中起重要作用[22]。 初级胆汁酸在肝脏中合成,在高胆固醇和高脂饮食诱导下,其代偿性增加能够促进多余脂质的分解和代谢[23]。 在本研究中,与对照组比较,模型组小鼠血清初级胆汁酸 β-MCA、CDCA、UDCA、TαMCA、TβMCA、TCDCA水平显著升高,经痰瘀同治优化方干预后,小鼠血清CDCA、UDCA、TβMCA水平显著降低。 当肠吸收脂质时,初级胆汁酸则经胆管被运输至十二指肠,在某些含有胆盐水解酶的肠道菌的作用下转化为次级胆汁酸,例如DCA、LCA和UDCA[24]。

次级胆汁酸常被讨论对机体健康具有负面影响[25],例如LCA是一种常见的疏水型胆汁酸,这种特性增加了胆汁酸分子与膜磷脂的黏附,可通过破坏细胞膜的完整性、促进活性氧产生和造成DNA损伤诱导肝损伤、 结肠癌等疾病[26-27]。 在本研究中,摄入高脂饮食导致AS模型组小鼠血清中次级胆汁酸LCA水平代偿性升高,肠道脂质分解代谢增加,而痰瘀同治优化方可改善小鼠脂质代谢,显著降低血清LCA水平。Bacteroides,Bifidobacterium和Clostridium等菌属已被证明具有胆盐水解酶活性,是LCA、DCA及其衍生物的重要产生来源[28],本实验结果表明,模型组小鼠肠道Bacteroides和Bifidobacterium丰度显著上升,并与DCA呈显著正相关,痰瘀同治优化方可通过调节Bacteroides和Bifidobacterium丰度来调节次级胆汁酸的含量,从而维持胆汁酸稳态。

综上本研究证明,痰瘀同治优化方能够显著降低血清TC、TG、LDL-C水平,减少AS斑块面积和脂质沉积,对AS进展具有抑制作用。 而且,痰瘀同治优化方还可以改善肠道菌群的结构和丰度,调节血清初级胆汁酸和次级胆汁酸代谢,提示痰瘀同治优化方治疗AS的作用机制可能与调节肠道菌群组成和胆汁酸代谢有关。

参考文献:

[4]唐丹丽,佟琳,张华敏,等.痰瘀同治方对高脂血症心肌缺血再灌注损伤大鼠血脂及代谢组学影响的实验研究[ J].中国中医基础医学杂志,2013,19(1):41-43.

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[8]刘思鸿.基于群体协同算法的中药复方优化方法研究及应用[D].北京:中国中医科学院,2022.

[9]宋剑南,周瑕菁,周玉萍,等.从高脂血症及动脉粥样硬化探讨痰瘀理论及痰瘀同治机制[ J].医学研究通讯,2001,30(8):24-25.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(81973722);中国中医科学院科技创新工程项目(CI2021A00604);中国中医科学院科技创新工程项目中医理论传承与创新专项(KYG-202404);

文章来源:李盈盈,李若琪,吴浩南,等.基于肠道菌群及胆汁酸代谢探讨痰瘀同治优化方抗动脉粥样硬化作用机制[J].中国中医基础医学杂志,2025,31(03):449-455.