动脉粥样硬化是一种缓慢进行性的血管炎症性病变,主要表现为内皮功能障碍、炎性细胞浸润、血管平滑肌细胞增殖、血管壁脂质异常沉积,形成含坏死核心的脂质斑块,若斑块破裂则可导致急性心肌梗死、缺血性卒中等并发症。动脉粥样硬化受遗传易感基因、表观遗传修饰以及环境因素的共同影响[1]。人类基因组非编码RNA如长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)等在表观遗传调控、转录调控和转录后调控基因表达中的作用受到广泛关注。其中,lncRNA在内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞,以及相关细胞因子构成的复杂网络中通过调控血管壁功能、脂质代谢和免疫反应,影响动脉粥样硬化进程[2]。

近年的实验证据表明lncRNA可以通过竞争结合共同的miRNA反应元件(microRNAresponseelements,MRE)实现RNA分子之间的相互调控,进而调节靶基因信使RNA(messengerRNA,mRNA)的水平和功能,这种全新的基因表达调控模式被称为竞争性内源RNA(competitiveendogenousRNA,ceRNA)机制[3]。本综述系统地介绍ceRNA调控网络的组成,并汇总lncRNA-miRNA-mRNA之间的ceRNA互作网络在动脉粥样硬化发生发展中的研究进展,以期为动脉粥样硬化性心血管疾病的临床诊断与治疗提供新思路。

1、ceRNA网络调控的组成及其作用机制

ceRNA理论揭示了一种全新的基因表达调控机制,涉及多种RNA分子,主要包括mRNA、miRNA、lncNRA和环状RNA。建立在RNA组学基础上的ceRNA调控网络,使人们对转录组调控的“基因语言”有了更深入的认识。

1.1mRNA

携带遗传信息并编码蛋白质的mRNA,是ceRNA调控网络的关键成员之一。真核生物mRNA的3′端非翻译区(3′-untranslatedregion,3′-UTR)序列通常包含与miRNA种子序列互补的结合域MRE。通过MRE,一个mRNA可以与多个miRNA相互作用进而形成调控网络。

1.2miRNA

miRNA是一类长度18～24个核苷酸的单链非编码小分子RNA,可与其靶基因mRNA的3′-UTR互补配对结合,在转录后水平抑制靶基因的翻译或降低靶基因mRNA的稳定性,从而抑制靶基因的表达[4]。miRNA作为“桥梁”,是ceRNA调控网络的核心RNA分子,一个miRNA可以调控多个靶基因,而相同的靶基因亦可以被不同的miRNA调控。

1.3lncRNA

lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA,具有组织特异性,物种保守性较低。lncRNA既可通过其独特的二级结构与蛋白质结合形成RNA-蛋白质复合物,也能与多个RNA相互作用形成复杂的基因表达调控网络[5]。lncRNA作为ceRNA分子,通过其3′-UTR区域的MRE与miRNA引导的沉默复合体结合,影响miRNA的有效浓度和活性,进而影响miRNA对其靶基因mRNA的抑制作用[3]。

1.4其他RNA分子

环状RNA是一类特殊的内源性RNA,结构稳定,组织表达特异性强。迄今为止,在人类细胞中发现了上千种环状RNA分子,但其作为ceRNA的转录调控机制尚未阐明[6]。

2、lncRNA基于miRNA的ceRNA网络调控影响动脉粥样硬化进程

lncRNA基于miRNA的ceRNA调控网络在内皮细胞功能障碍、平滑肌细胞表型转化和巨噬细胞激活等多个环节中影响动脉粥样硬化的进程。

2.1lncRNA对血管内皮细胞功能的ceRNA调控

血管内皮细胞(endothelialcells,EC)功能障碍是诱发动脉粥样硬化的始动环节。lncRNA可诱发EC炎症反应,激活核因子κB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)信号通路,促进动脉粥样硬化形成。例如,INK4位点反义非编码RNA(antisensenoncodingRNAintheINK4locus,ANRIL)位于冠心病遗传易感的关键位点9号染色体p21.3,在动脉粥样硬化性疾病患者的冠状动脉斑块组织和血浆中高表达。ANRIL可竞争性结合miR-181b,激活NF-κB信号通路,诱导EC炎症反应和内皮功能障碍[7]。lncRNA肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associatedlungadenocarcinomatranscript1,MALAT1)位于人11号染色体q3.1,在不稳定型心绞痛患者的血浆中表达上调。MALAT1竞争性结合miR-146,激活NF-κB信号通路,促进肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)的表达,诱导心肌梗死缺血区域细胞间黏附分子1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)和血管细胞黏附分子1(vascularcelladhesionmolecule-1,VCAM-1)的高表达,从而促进EC炎症反应和功能障碍[8]。MALAT1还可通过MALAT1/miR-181b调控轴促进氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,ox-LDL)诱导的内皮细胞炎症反应和氧化应激损伤[9]。

但不同的研究显示MALAT1对EC功能有双向调节作用。MALAT1可通过促进EC增殖、生长因子的分泌等方式维持血管功能,发挥抗动脉粥样硬化的作用。MALAT1竞争结合miR-22-3p,上调靶基因CXC趋化因子受体2(CXCchemokinereceptor2,CXCR2)的表达,CXCR2激活Akt信号通路发挥促进EC增殖、抗凋亡、延缓ox-LDL诱发的EC功能障碍[10]。MALAT1还可作为miR-216a-5p的分子海绵,解除miR-216a-5p对靶基因Beclin-1的抑制,增强EC的自噬和存活率[11]。在脑微血管内皮细胞实验中进行氧-葡萄糖剥夺研究,发现MALAT1通过靶向结合miR-145,促进血管内皮生长因子A和血管生成素2的高表达,诱导血管生成[12]。MALAT1可与多个miRNA分子互作,调节EC功能的作用机制仍需进一步研究。

越来越多的lncRNA被发现可与多个miRNA互作,通过ceRNA网络影响靶基因表达,改变EC功能和内环境稳态,影响动脉粥样硬化的进程。表1列出了与EC功能密切相关的lncRNA及其在动脉粥样硬化中的作用。

表1.lncRNA通过ceRNA机制调控血管内皮细胞功能及动脉粥样硬化

2.2lncRNA对血管平滑肌细胞功能的ceRNA调控

lncRNA参与调控血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)的增殖、迁移以及由收缩型到合成型的表型转化,lncRNA可竞争性结合多个miRNA分子,调控不同的靶基因,进而调节下游多种信号通路,影响VSMC功能。例如,lncRNAANRIL不仅与miR-181b竞争结合促进EC增殖,还可与miR-181a竞争结合调控去乙酰化酶Sirtuin1基因表达,进而抑制p53、p21表达,促进VSMC增殖和动脉粥样硬化斑块形成[23]。

lncRNA还可通过改变内皮细胞功能进而影响VSMC的增殖、迁移等。EC-VSMC之间的信号通讯由细胞外小泡介导,细胞外小泡富含lncRNA视网膜非编码RNA3(retinanoncodingRNA3,RNCR3)。RNCR3竞争性结合miR-185-5p,激活Kruppel样转录因子2(kruppelliketranscriptionfactor2,KLF2),高表达的KLF2可进一步抑制促炎基因,诱导EC和VSMC增殖和迁移,促进血管内斑块形成[24]。

lncRNA通过与不同的miRNA竞争结合,在VSMC功能和动脉粥样硬化形成中发挥着双向调控的重要作用。牛磺酸上调基因1(taurineupregulatedgene1,TUG1)可作为分子海绵竞争性结合miR-145-5p,减弱miR-145-5p对其靶基因纤维母细胞生长因子10(fibroblastgrowthfactor10,FGF10)的抑制作用,促进VSMC增殖和迁移[25]。然而,给予ox-LDL刺激VSMC时,TUG1可竞争性结合miR-148b,促进胰岛素样生长因子2(insulinlikegrowthfactor2,IGF2)表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)表达,同时下调促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(bcl-2-associatedXprotein,Bax)表达,抑制VSMC凋亡;敲除TUG1后,可减轻ox-LDL诱导的VSMC损伤,抑制细胞增殖,进而延缓动脉粥样硬化斑块形成[26]。

随着研究的深入,lncRNA在VSMC中的功能逐渐清晰。lncRNA竞争性减弱miRNA对靶基因的抑制作用,通过促进生长因子、炎症因子、凋亡及细胞周期蛋白表达等机制促进VSMC增殖、迁移进入内膜,由收缩型转变为合成型,聚集在泡沫细胞周围,加速动脉粥样硬化斑块的发展。表2列出了与VSMC功能密切相关的lncRNA分子及其对动脉粥样硬化的影响。

表2.lncRNA通过ceRNA机制调控血管平滑肌细胞功能及动脉粥样硬化

2.3lncRNA对单核巨噬细胞功能的ceRNA调控

单核细胞激活后进入血管壁,吞噬ox-LDL,分化为泡沫细胞,形成斑块的脂质核心。lncRNA通过ceRNA机制调控单核细胞的增殖、分化、黏附与迁移、以及炎症反应等,促进动脉粥样硬化的发展。lncRNA小核仁RNA宿主基因16(smallnucleolarRNAhostgene16,SNHG16)在冠心病患者的血清中表达升高,可竞争性结合miR-17-5p,激活NF-κB信号通路,释放大量炎症因子,促进炎症反应,诱导单核细胞浸润至血管壁内,促进巨噬细胞的增殖和炎症反应[38]。

lncRNA心肌梗死相关转录本(myocardialinfarctionassociatedtranscript,MIAT)可与多个miRNA结合,不仅通过MIAT/miR-150/VEGF信号轴促进EC的增殖、迁移和血管生成,加重心肌损伤[16],还可竞争性结合miR-149-5p,减弱miR-149-5p对靶基因分化簇47(clusterofdifferentiation-47,CD47)的抑制作用,导致动脉粥样硬化斑块的不稳定增加[39]。CD47可促进巨噬细胞向内皮迁移、黏附形成泡沫细胞,抑制凋亡细胞的清除,造成斑块内坏死细胞累积。在小鼠动物模型的研究中进一步发现,敲除MIAT后显著提高了巨噬细胞的吞噬清除率,增加斑块稳定性,延缓动脉粥样硬化的发展。

当前,多项研究证据显示lncRNA竞争性结合miRNA促进单核细胞迁移和黏附,调控巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞、释放炎症因子,从而促进纤维帽形成和斑块核心坏死等多个环节。表3列出了调控巨噬细胞增殖、迁移和炎症反应等功能的lncRNA分子及其对动脉粥样硬化的影响。

表3.lncRNA通过ceRNA机制调控巨噬细胞功能及动脉粥样硬化

2.4lncRNA对脂质代谢的ceRNA调控

尽管已有研究表明lncRNA作为ceRNA分子在脂质代谢中起重要作用,但其在动脉粥样硬化中的机制仍然需要更多的实验证据支持。lncRNANEAT1可与多个miRNA结合,影响动脉粥样硬化斑块形成。NEAT1不仅通过竞争性结合miR-128和miR-342-3p,发挥促进巨噬细胞炎症反应的作用[43,44],也参与了脂质代谢的调节。NEAT1竞争性结合miR-146a-5p,解除miR-146a-5p对Rho相关激酶(rho-associatedkinase,ROCK1)的抑制;NEAT1敲除后,miR-146a-5p表达上调,靶基因ROCK1表达受抑制,AMPK途径被激活,导致脂质积累减少[49]。

lncRNA除了影响脂质生成,还通过调节脂蛋白脂肪酶水平,影响巨噬细胞中胆固醇的累积,促进动脉粥样斑块中泡沫细胞的形成。lncRNADAPK1内含子转录本1(DAPK1intronictranscript1,DAPK1-IT1)竞争性结合miR-590-3p,促进脂蛋白脂肪酶表达,导致高密度脂蛋白胆固醇水平减少、低密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇水平增加,释放促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α,刺激单核巨噬细胞增殖、聚集、细胞内胆固醇累积形成泡沫细胞;过表达DAPK1-IT1后,可加速ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的形成[50]。

脂质浸润在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥着重要作用。上述研究证据显示lncRNA可竞争性结合不同miRNA,通过ceRNA调控网络促进脂肪生成,调节巨噬细胞的胆固醇吞噬和流出能力,加速巨噬细胞内脂质累积,影响斑块稳定性,从而调控动脉粥样硬化的进展。

3、lncRNA在动脉粥样硬化性疾病中的临床转化前景

动脉粥样硬化的发生发展伴随着机体内环境稳态的破坏,探讨动脉粥样硬化的关键机制和分子标志物的研究可为动脉粥样硬化性疾病防治提供新思路。一些lncRNA分子在冠心病患者血浆以及动脉粥样硬化斑块组织中异常表达,针对lncRNA的靶向治疗可能发挥类似他汀类调脂药的效果。例如,lncRNAANRIL在冠心病患者血浆以及动脉粥样硬化斑块组织中异常高表达[7],MALAT1和H19在不稳定型心绞痛患者血浆中表达上调[8,28],有望成为急性冠状动脉综合征和动脉粥样硬化发展的预警分子标志物。此外,lncRNARAPIA在巨噬细胞中高表达,竞争性结合miR-183-5p,减弱其对整合素β1的抑制作用,促进巨噬细胞凋亡;动物实验显示抑制RAPIA的效果与阿托伐他汀的治疗作用类似,可减少动脉粥样硬化晚期斑块中的脂质积聚、缩小斑块体积,可能成为抗动脉粥样硬化的新靶点[41]。然而,lncRNA影响靶基因的信号通路机制复杂,同一个lncRNA在不同的细胞微环境中,可竞争性结合不同的miRNA,通过调节内皮细胞功能、平滑肌细胞表型转化和巨噬细胞功能等多个环节,影响动脉粥样硬化的进展。因此,lncRNA的作用机制仍需深入研究,在临床转化方面,还有很长的路。

4、结语

lncRNA-miRNA-mRNA之间互作的ceRNA网络调控通过MRE竞争性结合相同的miRNA,在基因调控中发挥重要作用。随着全转录组测序技术和高通量芯片技术的发展,通过构建miRNA文库和lncRNA测序可以获得丰富的mRNA、miRNA和lncRNA差异表达信息,为进一步分析RNA分子之间的相互作用打下基础,有助于明确ceRNA和疾病之间的关系。本文总结了动脉粥样硬化相关的lncRNA在EC、VSMC、巨噬细胞以及脂质代谢中的ceRNA调控机制,这些研究为动脉粥样硬化性疾病的诊断与治疗提供了新思路。但因lncRNA靶点众多且ceRNA机制复杂,仍然需要探究每条通路的具体机制。未来的工作应聚焦ceRNA网络平衡性,将有可能针对动脉粥样硬化病变过程中差异表达的lncRNA进行有效干预,有望为动脉粥样硬化性疾病的早期预警和治疗提供有价值的生物标志物及新的治疗靶点。

参考文献：

[2]易明,刘强,柯晓.长链非编码RNA在动脉粥样硬化中的研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2020,28(6):533-543.

韩爽,陈宇,张伟丽.长链非编码RNA的竞争性内源RNA调控模式在动脉粥样硬化中的研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2021,29(03):185-192.

基金:国家自然科学基金项目资助(81873492､81670338)