动脉粥样硬化发病率日益增高，病理机制主要是动脉血管内壁的慢性炎症所致，炎症可以加速动脉粥样硬化的进展和斑块的形成[1]。动脉硬化引发的血管栓塞易引起心肌梗死，许多信号通路如LKB1-AMPK-AKT1以及PI3K/PTEN等与动脉粥样硬化疾病关系密切[2,3]。临床上采用了他汀类药物调节血脂、活血化瘀、抗炎等方法开展治疗，有效延缓了斑块的进展[4,5,6]。但仍需要寻找靶点特异性高、作用效果好的新型药物制剂。

骨髓作为传统的造血器官，维持了机体的能量和营养，而关于骨髓细胞调控代谢的研究则知之甚少。髓源性生长因子(MYDGF)是一种主要由骨髓单核细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子，可以改善心肌梗死后心肌功能，促进心脏再生[7]。作者团队最新研究发现MYDGF可以改善糖尿病小鼠的胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱[8]，而胰岛素抵抗与糖脂代谢紊乱和动脉粥样硬化的发展息息相关[9,10]，因此MYDGF是否可以改善动脉粥样硬化的发展值得关注。骨髓特异性MYDGF基因敲除小鼠容易构建，易饲养和繁殖，存活能力强，毛色光泽，成本经济合理。此外，动物体内缺乏载脂蛋白E(ApoE)，则会导致血液循环胆固醇大量积累，促进动脉粥样硬化形成[11]。ApoE基因敲除小鼠存在严重的脂蛋白清除障碍和高胆固醇血症[12]。西方饮食可以加速ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型构建[13]。因此该研究初步探讨MYDGF缺失对西方饮食下ApoE基因小鼠动脉粥样硬化的影响。

此次研究首次在ApoE敲除小鼠中进行骨髓特异性的MYDGF基因敲除，产生骨髓特异性MYDGF缺失的ApoE敲除小鼠，即MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠，为实验所需的双敲小鼠，单纯的ApoEflox/flox小鼠为实验对照组，并进行基因水平和蛋白组织水平的验证，观察两种敲除小鼠的表型差异，初步比较西方饮食喂养下ApoEflox/flox小鼠骨髓MYDGF缺失对动脉粥样硬化的影响，研究具有一定创新性和重要的基础研究意义。

1、材料和方法

1.1 设计

构建双敲小鼠模型，基因和蛋白组织水平检测，两组比较采用t检验。

1.2 时间及地点

实验于2018年4月至2019年3月在中国人民解放军中部战区总医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

无特定病原体级C57BL/6J背景特异性MYDGF敲除雌性小鼠(MYDGFflox/flox)10只，4周龄，体质量(15.09±0.94)g,ApoEflox/flox雄鼠5只，4周龄，体质量(15.38±1.04)g，以上小鼠均购于上海南方模式生物科技股份有限公司[14,15]，实验动物许可证号：SYXK(沪)2017-0012，上述小鼠的颜色均为黑色；4周龄C57野生型(WT)小鼠6只，雌性各半，作为小鼠基因型鉴定的对照，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。所有实验小鼠均饲养在华中科技大学动物实验中心SPF级动物房，湿度控制在55%-75%，室内温度控制在(25±2)℃[16,17]。

1.3.2 小鼠西方饮食

小鼠出生后接受正常饮食(10%脂肪，70%碳水化合物和20%蛋白质)喂养，自8周龄开始，喂食西方饮食饲料(40%脂肪，43%碳水化合物和17%蛋白质)持续12周，饲料购买于北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.3.3 实验用主要试剂

PremixTag酶(购买于武汉巴菲尔公司)；DNTP试剂、ddH2O(购买于武汉拜意尔生物公司)；PCR引物委托上海生物工程有限公司进行合成；鼠尾裂解液(购买于武汉华联科生物技术有限公司)[18,19]；兔抗MYDGF(Proteintech,#11353-1-AP)；鼠抗GAPDH(CST,#5174)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(#111-035-003)、抗鼠IgG(#115-035-146)(USA)。

1.4 实验方法

1.4.1 MYDGFflox/flox纯合子小鼠的养殖及鉴定

取8周龄的MYDGFflox/+雄鼠3只与8周龄的MYDGFflox/+雌鼠6只进行交配，繁殖出F1子代小鼠一共30只，颜色均为黑色。用解剖剪剪取2周龄上述小鼠的鼠尾5mm，分别装入写好相应编号的1.5mL的EP管内，采用PCR法进行小鼠基因型的鉴定。鉴定方法如下：在1.5mL装有鼠尾的EP管中加入100μL的裂解液A液，在离心机中以15000r/min的转速离心2min，随后放入温度为96℃金属水浴锅中，煮沸1h；离心后加入100μL的鼠尾裂解液B液，离心机中15000r/min转速离心2min。MYDGF的PCR引物序列为：MYDGF-1:5’-CGTAAGTGAGTCCGGGACC-3’;MYDGF-2:5’-TGTTTGGGTTGGAGTTTGC-3’;MYDGF-3:5’-AGGGCTATTGCCTGCTGT-3’。PCR反应体系20μL:2×PCRmix10μL，上游引物2μL(调整终浓度100nmol)，下游引物2μL(调整终浓度100nmol)，模板4μL,dd超纯水2μL。PCR反应条件：94℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃1min,72℃5min，循环共35次，在4℃保存。配制2%的琼脂糖凝胶，PCR上机结束后，用移液枪移取10μL模板DNA小心加入上样孔中，电泳半小时后对琼脂糖凝胶进行成像系统拍照，记录PCR鉴定结果[20]。

1.4.2 ApoEflox/flox纯合子小鼠的养殖及鉴定

选择ApoEflox/+雄性小鼠2只与ApoEflox/+雄性小鼠4只进行交配，顺利繁殖出实验所需的ApoEflox/flox纯合子小鼠5只。参照1.4.1的方法采用PCR法进行小鼠ApoE基因型的鉴定。ApoE引物序列：APOE-1:5’-GCCTAGCCGAGGGAGAGCCCG-3’;APOE-2:5’-TGTGACTTGGGAGCTCTGCAGC-3’;APOE-3:5’-GCCGCCCCGACTGACTCT-3’。PCR体系20μL:2×PCRmix10μL，上游引物2μL(调整终浓度100nmol)，下游引物2μL(调整终浓度100nmol)，模板4μL,dd超纯水2μL。PCR反应条件：94℃3min,94℃30s,59℃40s,72℃1min,72℃2min，循环共35次，在4℃保存。随后进行PCR上机和凝胶拍照。

1.4.3 MYDGFflox/floxApoEflox/flox双基因敲除纯合子小鼠的繁殖和鉴定

选取5只ApoE敲除小鼠与10只骨髓特异性MYDGF敲除小鼠进行交配，得到基因型为MYDGFflox/+ApoEflox/+F1子代小鼠30只，将30只MYDGFflox/+ApoEflox/+小鼠互相进行交配，得到基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠30只、ApoEflox/flox小鼠34只，MYDGFflox/+ApoEflox/+小鼠20只，MYDGFflox/flox小鼠15只，MYDGF+/+ApoE+/+小鼠15只，MYDGFflox/+小鼠10只，APOEflox/+小鼠9只，其中基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox的小鼠即为实验所需建立的骨髓特异性敲除MYDGF基因ApoEflox/flox纯合子小鼠模型。参照1.4.1的方法鉴定64只子代小鼠的MYDGFflox及ApoEflox基因型。

1.4.4 Westernblotting法检测小鼠骨髓组织的MYDGF蛋白表达

取8周龄的MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠和ApoEflox/fllox小鼠各3只，麻醉处死，取适量骨髓组织，研碎后放入编好号的EP管内，加入100μL蛋白裂解液裂解组织，100℃水浴锅中煮沸10min。配制10%的PAGE凝胶，用移液枪吸取6组蛋白样品各10μL于上样孔中，电泳2h，用PVDF将目标蛋白进行转膜，常温下用5%的脱脂奶粉在摇床上封闭1h。之后剪下PVDF膜中目标条带，放入抗体孵育盒中，分别加入兔抗MYDGF(1∶1000)、鼠抗GAPDH(1∶4000)的一抗稀释液各3mL，注意完全覆盖PVDF膜，将抗体孵育盒放在4℃冰箱的摇床过夜。次日，用1×TBST洗膜3次，每次5min，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶3000)和抗鼠IgG(1∶3000)二抗孵育1h,1×TBST洗涤3次，每次5min后，在暗室进行胶片曝光显影，用胶片扫描仪扫描。GAPDH为内参，以MYDGF蛋白与GAPDH灰度值的比值计算MYDGF蛋白相对表达量[21]。

1.4.5 免疫荧光法检测小鼠骨髓组织的MYDGF蛋白表达

取8周龄MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠和ApoEflox/fllox小鼠各3只，麻醉处死后取股骨，脱钙处理石蜡包埋，切片厚度为4μm。将切片进行常规脱蜡水化，小心滴加100μL的兔抗小鼠的MYDGF(1∶200),4℃过夜，洗涤3次后，在室温摇床上用异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗孵育1h,PBS洗涤3次，DAPI显色15s，在暗室中使用荧光显微镜下拍照[22]。

1.4.6 油红O染色检测小鼠胸主动脉的斑块面积

用40g/L的多聚甲醛固定小鼠的胸主动脉48h，取新鲜配制的油红O染液染色30min，照相观察胸主动脉的斑块与胸主动脉总面积的百分比。

1.5 主要观察指标

(1)小鼠的体长和体质量；(2)PCR基因鉴定结果；(3)小鼠的骨髓组织MYDGF蛋白表达及免疫荧光表达；(4)小鼠胸主动脉斑块面积。

1.6 统计学分析

采用SPSS20.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用两样本t检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 MYDGFflox小鼠基因型鉴定结果

PCR电泳实验结果显示，MYDGFflox/flox纯合子小鼠可见355bp一条条带，MYDGFflox/+杂合子小鼠可见355bp和87bp两条条带。结果经统计，共繁殖出MYDGFflox/flox纯合子小鼠10只，MYDGFflox/+杂合子小鼠12只，见图1。

2.2 ApoEflox小鼠基因型鉴定结果

PCR电泳实验结果显示，ApoEflox/flox小鼠可见254bp一条条带，ApoEflox/+小鼠可见254bp和155bp两条条带，见图2。

2.3 ApoEflox/flox小鼠骨髓特异性敲除MYDGF基因的鉴定结果

经PCR电泳实验结果统计，共鉴定出基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox的小鼠30只、单纯的ApoEflox/flox小鼠34只，见图3。

经测量和称质量统计分析，2月龄的单纯ApoEflox/flox敲除鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox的对照小鼠体长分别为(18.49±0.83),(18.41±0.80)cm(t=0.395,P=0.694)；体质量分别为(24.04±1.82),(24.12±1.83)g(t=0.172,P=0.864)。二者体长、体质量比较，差异无显著性意义(均P>0.05)。

2.4 ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓组织MYDGF蛋白表达

WesternBlot结果显示，ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓组织MYDGF蛋白相对表达量分别为(0.72±0.08),(0.07±0.05)(t=17.44,P=0.0001)；证实成功敲除MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠的骨髓组织MYDGF基因，见图4。

2.5 ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓MYDGF免疫荧光染色

免疫荧光染色结果发现，在骨髓细胞MYDGF阳性个数表达中，MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓细胞MYDGF阳染个数明显低于ApoEflox/flox小鼠，ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓组织MYDGF荧光相对表达量分别为(60.33±10.13)%,(9.83±1.72)%(t=12.04,P=0.0001)；说明MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠成功在骨髓细胞上敲除了MYDGF基因，见图5。

2.6 ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠西方饮食条件下胸主动脉油红染色

取8周龄ApoEflox/flox和MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠各6只，西方饮食喂养3个月后，取2组小鼠的胸主动脉组织，进行油红O染色。油红染色结果显示，与ApoEflox/flox小鼠相比，MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠胸主动脉表面斑块面积明显增加，ApoEflox/flox小鼠与MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠胸主动脉斑块面积分别为(8.00±2.37)%,(17.33±2.58)%,t=6.528,P=0.0001，二者比较P<0.05；说明MYDGF基因缺乏可以加重APOE基因敲除小鼠的动脉粥样硬化，见图6。

3、讨论

MYDGF是一种由位于第19位染色质的开放阅读框的基因C19orf10编码的分泌蛋白[23,24]，主要由单核细胞和巨噬细胞分泌[25]，最新研究表明MYDGF可以改善心肌梗死，促进毛细血管新生，这种蛋白通过MAPK1/3和STAT3基因介导的信号转导通路刺激内皮细胞的增殖，通过PI3K/Akt依赖性信号转导通路减少心肌细胞凋亡[26]，以上研究提示rMYDGF作为一种新型蛋白在心血管治疗领域可能具有良好的前景[27,28]。此次实验首次构建ApoEflox/flox小鼠的骨髓组织敲除MYDGF基因的模型，在动物体内实验水平中分析MYDGF基因在动物动脉粥样硬化形成、发展和缓解中有重要意义。国内目前关于MYDGF的研究较少，资料文献尚不完善。MYDGF对动脉粥样硬化的影响及是否具有改善或延缓动脉粥样硬化的功能机制仍然不是很清楚，研究MYDGF与代谢性疾病，如2型糖尿病、NAFLD和动脉粥样硬化等的相互作用就变得十分有意义。因此，构建骨髓特异性敲除MYDGF基因的ApoEflox/flox小鼠模型对于研究MYDGF在动脉粥样硬化疾病中的作用具有重要意义。

此次实验结果证实MYDGFflox/flox小鼠的骨髓细胞MYDGF基因被敲除，而其他组织及细胞内的MYDGF基因正常存在，因此有利于研究骨髓中MYDGF缺失对代谢的调控作用。根据Cre/loxp条件基因敲除技术原理，MYDGFflox/flox小鼠与ApoEflox/flox的纯合子小鼠杂交产生MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠，为骨髓细胞特异性缺失MYDGF的ApoE小鼠。因此，构建基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox的纯合子小鼠对于研究MYDGF基因在动脉粥样硬化等代谢性疾病的发生发展具有重要作用。在此次实验中，利用Cre/loxp条件性基因敲除技术，繁殖出基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠30只、ApoEflox/flox小鼠34只。结果显示2组小鼠的体长及体质量没有明显差异，证实了骨髓特异性敲除MYDGF基因对小鼠的生长、外显和体质量没有影响。

MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠MYDGF基因鉴定结果可见355bp条带，说明其为MYDGFflox/flox小鼠；ApoEflox/flox基因鉴定结果只见254bp条带，说明其为MYDGFflox/flox小鼠。因此，基因型为MYDGFflox/floxApoEflox/flox的小鼠即为此次实验所需建立的骨髓特异性敲除MYDGF基因ApoEflox/flox小鼠。因为小鼠是髓源性特异性敲除MYDGF基因，因此研究选取骨髓组织作为蛋白免疫印迹和免疫荧光的检测标本，结果显示，与ApoEflox/flox小鼠相比，MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓组织MYDGF蛋白表达量明显减少，且MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓组织中MYDGF免疫荧光表达量明显下降，进一步验证了成功敲除了MYDGFflox/floxApoEflox/flox小鼠骨髓细胞的MYDGF基因。最后，油红O染色结果显示在西方饮食条件下，MYDGF敲除加剧了ApoE小鼠的胸主动脉斑块进展，说明MYDG可能对动脉粥样硬化发挥一定的保护作用。

此次研究也存在以下不足。首先，基因敲除小鼠饲养需要控制好实验条件[29]；其次，基因敲除小鼠的繁殖周期较长[30]，基因鉴定和蛋白电泳实验要求高[31]；最后，关于动脉粥样硬化及其他代谢性疾病的研究还没有进行深入探索。作者团队前期报道发现MYDGF通过激活糖尿病肾病小鼠的Akt/BAD信号通路可以减轻足细胞损伤和蛋白尿[21]，说明MYDGF可以缓解糖尿病肾病的进展，且国外有研究报道，MYDGF与肝细胞癌症的增殖和激活密切相关[32]，进一步验证了MYDGF在代谢和肿瘤疾病的调控中均发挥重要作用。在之后的研究中，作者将通过构建腺病毒MYDGF，升高小鼠体内的MYDGF水平，观察各处理组小鼠动脉斑块和脂肪肝的情况，深入探讨MYDGF缺失与心血管疾病、代谢调控的关系，并提供新的治疗和作用靶点。

综上所述，文章利用Cre/loxp技术构建了骨髓特异性敲除MYDGF基因的ApoEflox/flox小鼠模型，并成功鉴定出MYDGFflox/floxApoEflox/flox的小鼠和ApoEflox/flox小鼠的基因型。在蛋白水平上验证了敲除小鼠MYDGF蛋白水平的降低，在组织水平上验证了骨髓细胞MYDGF荧光定量表达降低。实验初步证实了骨髓中的MYDGF对动脉粥样硬化的发展发挥作用，其相关分子机制需要进一步探索。

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文章来源：丁燕,向光大,孟碧莹,徐晓丽,陈月富.建立载脂蛋白E基因敲除小鼠骨髓髓源性生长因子缺失模型及鉴定[J].中国组织工程研究,2022,26(14):2196-2201.