动脉粥样硬化是临床中常见的动脉血管病变，其发病机制与饮食因素及高血压等多种因素密切相关，如不及时干预，可能会引发多种组织器官缺血，甚至进展为动脉血管闭塞，危及患者生命[1]。然而，目前临床中对于动脉粥样硬化的治疗手段及预后效果有限，不能显著逆转动脉粥样硬化的病理进展，所以对于抗动脉粥样硬化药物的研发是目前亟待解决的问题[2]。研究表明，动脉粥样硬化与动脉血管内炎症免疫反应有关，炎症免疫相关蛋白水平的异常是导致动脉粥样硬化发生发展的重要因素[3]。秦皮素作为一种从植物中提取得到的单体化合物，其具有抗菌、抗肝纤维化等多种药理作用[4],有研究表明，其具有显著的抗炎作用[5],然而目前秦皮素对于动脉粥样硬化的治疗作用及机制，尚未见报道。本文探讨秦皮素对大鼠动脉粥样硬化修复作用及其对炎症免疫相关蛋白的调节作用。

1、材料与方法

1.1实验动物

75只雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量200～240 g,健康清洁级，购自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心，实验动物生产许可证号SCXK(新)2021-0001,饲养于动物房，温度20～25℃,相对湿度40%～70%,自然光照，自由饮食，适应性饲养1 w后进行实验。

1.2药品及试剂

秦皮素(上海源叶生物科技有限公司，货号B20990);辛伐他汀(北京双鹭药业股份有限公司，批号1909111,规格10 mg);高糖高脂饲料(上海锐赛生物技术有限公司，货号RD12492);RNA提取试剂盒、聚合酶链反应(PCR)试剂盒(万类生物科技有限公司，货号WLA088、WLA071);低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司，货号CSB-E16561r-1、CSB-E08240r-1);总胆固醇(TC,货号EK-R38996)、白细胞介素(IL)-6(上海酶研生物科技有限公司，货号EK-R36902);IL-8(货号A-3051,本生健康科技有限公司);肿瘤坏死因子(TNF)-α(南京赛泓瑞生物科技有限公司，货号SEA133Rb03);单核细胞趋化蛋白(MCP)-1(北京义翘神州科技股份有限公司，货号50368-T16);还原型谷胱甘肽(GSH)-Px,北京伊塔生物科技有限公司，货号SY6454);超氧化物歧化酶(SOD,碧云天生物科技有限公司，货号S0101S);丙二醛(MDA,上海吉至生化科技有限公司，货号BC0020);活性氧(ROS)试剂盒(上海鑫乐生物科技有限公司，货号xl-Er0070);苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(碧云天生物科技有限公司，货号G1120);MCP-1、MCP诱导蛋白(MCPIP)兔多克隆抗体、趋化因子受体(CCR)2、C-反应蛋白(CRP)及基质金属蛋白酶(MMP)-9兔单克隆抗体(艾博抗贸易有限公司，货号ab25124、ab230502、ab227236、ab183029、ab76003)。

1.3设备与仪器

ABI9700 PCR仪(美国ABI公司);IX83荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯);Gel Doc EZ凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司);himac CR22N高速冷冻离心机(艾本德中国有限公司);MY-10组织匀浆器(上海研卉生物科技有限公司)。

1.4造模及给药

72只大鼠随机分为对照组(12只)及造模组(63只),采用腹腔注射维生素D3联合高脂饲料喂养[6]建立动脉粥样硬化大鼠模型。大鼠称重后按照60×104 IU/kg的剂量腹腔注射给予大鼠维生素D3,并于当日开始采用高脂饲料连续喂养8 w后，随机取3只大鼠进行冠状动脉病理学检查，以大鼠血清LDL-C、TC及TG水平升高，冠状动脉出现粥样硬化病理性改变视为造模成功。造模完成后随机分为动脉粥样硬化模型组、秦皮素低、中、高剂量组及辛伐他汀组各12只，秦皮素各剂量组分别腹腔注射给予25、50、100 mg/kg[7]秦皮素，辛伐他汀组灌胃给予5 mg/kg[8]辛伐他汀，对照组给予生理盐水，1次/d,连续给药8 w[8]。

1.5血清LDL-C、TC及TG水平测定

大鼠眼眶取血，在4℃下以6 000 r/min,离心15 min,取上清液，按照酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒说明书方法检测血清LDL-C、TC及TG水平。

1.6冠状动脉TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1、GSH-Px、SOD、MDA及ROS水平测定

取大鼠冠状动脉，在冰盒上充分研磨匀浆后，8 000 r/min, 4℃下离心10 min,取上清液，使用试剂盒测定TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1、GSH-Px、SOD、MDA及ROS水平。

1.7冠状动脉病理学检查

分离大鼠冠状动脉，将其固定于4%中性甲醛中24 h后，包埋于石蜡中，然后切成5μm切片，按照常规HE染色方法进行染色，使用光学显微镜对冠状动脉进行组织病理学检查。

1.8冠状动脉MCP1、CCR2、MCPIP、CRP及MMP-9mRNA水平测定

使用Trizol试剂进行冠状动脉mRNA的提取，逆转录为cDNA后，使用PCR仪进行测定各基因表达量，结果以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达水平。PCR条件如下：95℃预变性3 min, 94℃ 变性30 s, 60℃延伸30 s, 72℃,30 s,共计40个循环。通过2-ΔΔCt方法计算相对基因表达。反应体系：PCR预混液10μl,正反向引物各0.8μl,模板DNA 1μl,使用无RNA酶水补充至20μl。引物序列为GAPDH:正向引物5′-CACCCGCGAGTACAA-3′,反向5′-CCCATACCCA-CCATC-3′;MCP1:正向引物5′-TCGCCCGTAGCTTA-TCAGACT-3′,反向5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′;CCR2:正向引物5′-CGCTTCGGCATATAC-3′,反向5′-TTCACGAATTGTCATC-3′;MCPIP:正向引物5′-TCCAAGAGATGAATGCCAATGC-3′,反向5′-CAGAAGGAGCCGAGATGATGA-3′;CRP:正向引物5′-AGAGGTTGCAGGCGTTAAA-3′,反向5′-CACGGAA-CCAGAGAAGATACAC-3′;MMP-9:正向引物5′-CATCACATCACCTATCGAGTGA-3′,反向5′-CTTTCCTTGCTGCTAAGACATC-3′。

1.9冠状动脉MCP1、CCR2、MCPIP、CRP及MMP-9蛋白测定

使用放射免疫沉淀(RIPA)裂解液裂解冠状动脉组织，在4℃条件下，使用离心机按照12 000 r/min,离心10 min,取上清液，用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒对蛋白质浓度进行测定。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h,在含有0.1% Tween20 (TBST)缓冲液的Tris缓冲液中洗涤3次，5 min/次，随后在4℃条件下与GAPDH、MCP1、CCR2、MCPIP、CRP及MMP-9兔单克隆抗体(1∶1 000)孵育过夜。之后，使用TBST洗涤3次，在室温下与辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶2 000)孵育1 h,使用增强型化学发光检测试剂检测蛋白表达，通过ImageJ1.12分析各蛋白光密度，以GAPDH为内参，计算各蛋白相对表达量。

1.10统计学方法

采用SPSS26.0软件进行方差分析、LSD-t、χ2检验。

2、结 果

2.1秦皮素对动脉粥样硬化大鼠血清LDL-C、TC及TG的影响

如表1所示，与对照组比较，动脉粥样硬化模型组血清LDL-C、TC及TG水平显著升高(P<0.05);与动脉粥样硬化模型组比较，秦皮素低、中、高剂量组及辛伐他汀组血清LDL-C、TC及TG水平显著降低(P<0.05),且随着秦皮素剂量的增加，各剂量组血清LDL-C、TC及TG水平呈明显剂量依赖性降低(均P<0.05)。

2.2秦皮素对动脉粥样硬化大鼠冠状动脉GSH-Px、SOD、MDA及ROS的影响

如表1所示，与对照组比较，动脉粥样硬化模型组冠状动脉GSH-Px及SOD水平显著降低，MDA及ROS水平显著升高(P<0.05);与动脉粥样硬化模型组比较，秦皮素低、中、高剂量组及辛伐他汀组GSH-Px及SOD水平显著升高，MDA及ROS水平显著降低(P<0.05),且随着秦皮素剂量增加，各剂量组GSH-Px及SOD水平呈明显剂量依赖性升高，MDA及ROS水平呈明显剂量依赖性降低(均P<0.05)。

2.3秦皮素对动脉粥样硬化大鼠冠状动脉TNF-α、IL-6、IL-8及MCP-1的影响

如表2所示，与对照组比较，动脉粥样硬化模型组冠状动脉TNF-α、IL-6、IL-8及MCP-1水平显著升高(P<0.05);与动脉粥样硬化模型组比较，秦皮素低、中、高剂量组及辛伐他汀组TNF-α、IL-6、IL-8及MCP-1显著降低(P<0.05),且随秦皮素剂量的增加各剂量组TNF-α、IL-6、IL-8及MCP-1水平呈明显剂量依赖性降低(均P<0.05)。

表1各组血清LDL-C、TC、TG水平及冠状动脉GSH-Px、SOD、MDA、ROS水平比较

表2各组冠状动脉TNF-α、IL-6、IL-8及MCP-1水平比较

2.4秦皮素对动脉粥样硬化大鼠冠状动脉病理学影响

如图1所示，对照组冠状动脉结构正常，未发生明显病理性改变。与对照组比较，动脉粥样硬化模型组冠状动脉管壁增厚，平滑肌增生伴局部钙化；与对照组比较，秦皮素各剂量组及辛伐他汀组冠状动脉病理学改善，管壁增厚不同程度缓解，冠状动脉组织病理学明显改善。

2.5秦皮素对动脉粥样硬化大鼠冠状动脉MCP1、CCR2、MCPIP、CRP及MMP-9mRNA及蛋白表达的影响

如表3、表4、图2所示，与对照组比较，动脉粥样硬化模型组冠状动脉MCP1、CCR2、MCPIP、CRP、MMP-9 mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.05);与动脉粥样硬化模型组比较，秦皮素低、中、高剂量组、辛伐他汀组冠状动脉MCP1、CCR2、MCPIP、CRP、MMP-9 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05),且随秦皮素剂量的增加，各剂量组MCP1、CCR2、MCPIP、CRP、MMP-9 mRNA及蛋白表达呈明显剂量依赖性降低(均P<0.05)。

图1各组冠状动脉病理学(HE染色，×200)   下载原图

表3各组冠状动脉MCP1、CCR2、MCPIP、CRP及MMP-9 mRNA表达比较

表4各组冠状动脉MCP1、CCR2、MCPIP、CRP及MMP-9蛋白表达比较

图2各组冠状动脉MCP1、CCR2、MCPIP、CRP及MMP-9蛋白表达 

3、讨 论

动脉粥样硬化是由于高血压、高脂血症、糖尿病及遗传因素等多种诱因引起的动脉血管病变，由此引起的血管管腔狭窄及血栓形成是各种组织器官缺血性病变的重要原因。其中，冠状动脉粥样硬化是临床中较为常见的一种类型，也是心绞痛、心肌梗死等疾病发生的重要原因。目前，临床中对于动脉粥样硬化的治疗一般使用降血脂药物、抗血小板药物等进行治疗，并不能从根本上改变动脉粥样硬化的病理改变，并可能会引发多种出血风险，同时，常见的动脉再通术、管腔内放置支架等介入治疗对于患者的预后效果也有限，所以，对于动脉粥样硬化治疗药物的研发仍是目前主要工作重点之一[9]。

炎症免疫通路调节是近年来提出的治疗动脉粥样硬化的新观点，也是动脉粥样硬化治疗药物开发的新思路。罗洁等[10]研究表明，动脉粥样硬化的发生发展与动脉血管炎症免疫相关蛋白水平异常有关，MCP1、CCR2、MCPIP、CRP水平的升高会导致动脉粥样硬化的发生及进展，同时抑制MCP1、CCR2、MCPIP、CRP水平则能够有效改善和缓解动脉粥样硬化的进展。魏刚等[11]研究报道，MCP1、CRP、MMP-9水平升高是导致动脉炎症反应及发生粥样硬化的关键因素。刘淑玲等[6]研究表明，抑制炎症因子水平能够显著改善动脉血管内皮功能，进而抑制动脉粥样硬化的进展。可见炎症免疫调节相关蛋白在动脉粥样硬化的进展中起着重要作用，同时也表明调节炎症免疫相关蛋白可能是治疗动脉粥样硬化的有效途径。本实验结果提示，秦皮素能够显著抑制冠状动脉MCP1、CCR2、MCPIP、CRP及MMP-9蛋白水平，进而显著抑制大鼠动脉病理性改变。

LDL-C、TC及TG水平是反映血脂水平的重要指标，LDL-C、TC及TG水平升高是动脉粥样硬化进展的重要诱因[12]。GSH-Px、SOD、MDA及ROS水平是体现氧化应激损伤的指标，GSH-Px及SOD水平降低及MDA、ROS水平升高是氧化应激损伤的重要体现[13]。TNF-α、IL-6、IL-8及MCP-1是炎症反应发生的重要表现，TNF-α、IL-6、IL-8及MCP-1水平升高则表明炎症反应的发生及进展[14]。秦皮素是从水犀科植物小叶白蜡树中提取得到的香豆素类化合物，其具有显著的抗菌、抗肝纤维化及抗肿瘤等药理作用。陈美华等[15]研究发现，秦皮素具有显著的抗炎及血管保护作用，能够抑制炎症反应及氧化应激损伤，进而修复脑缺血再灌注损伤。江芮等[16]研究表明，秦皮素在体外PC12细胞中具有显著的炎症抑制作用，进而改善PC12细胞炎症损伤。本实验结果提示，秦皮素显著抑制体内炎症反应。

综上，秦皮素能够显著改善大鼠动脉粥样硬化状态，调节血脂水平，抑制冠状动脉炎症及氧化应激损伤，其机制可能与调节炎症免疫通路有关。

参考文献:

[6]刘淑玲,蔡海荣,陈燕虹,等.红花黄色素对动脉粥样硬化大鼠内皮功能､炎症反应､氧化应激的影响[J].中国老年学杂志,2019;39(18):4585-8.

[7]吴斌,王蓉,李胜男,等.秦皮素通过调节JAK1/STAT3信号通路抑制肝纤维化[J].中南药学,2019;17(3):420-5.

[8]白莉,钮晓淑,方伟蓉,等.灵仙新苷对动脉粥样硬化大鼠血脂的调节和CD36､VCAM-1表达的影响[J].中药药理与临床,2014;30(4):16-9.

[10]罗洁,秦旭,韦余,等.大豆异黄酮对动脉粥样硬化大鼠炎症分子相关基因表达的影响[J].江苏大学学报(医学版),2014;24(2):99-104.

[11]魏刚,包小敏,张英,等.阿托伐他汀与一氧化碳供体分子3联用对动脉粥样硬化易损斑块模型大鼠炎症及氧化应激指标的影响[J].中国药房,2019;30(3):338-43.

[15]陈美华,张燕,陈伟,等.秦皮素对脑缺血再灌注损伤小鼠的保护作用[J].中国老年学杂志,2016;36(10):2350-2.

[16]江芮,吕浩,李申,等.秦皮素抑制NF-κB/COX-2信号通路改善PC12细胞损伤[J].沈阳药科大学学报,2017;34(6):513-8.

基金资助:新疆维吾尔自治区自然科学基金(2020D01C139);

文章来源:江钰,胡金霞,赵翠霞,等.秦皮素对大鼠动脉粥样硬化修复及对炎症免疫因子的调节作用[J].中国老年学杂志,2024,44(12):2974-2978.