动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是造成我国居民死亡的主要原因之一[1]。他汀类药物作为内源性胆固醇合成限速酶甲基戊二酰辅酶A(HMG-Co A）还原酶的竞争性抑制剂，近30年来已被大量研究[2]证实，其具有降脂作用及降低心肌梗死、中风、冠状动脉血运重建等主要血管事件风险的远期获益，是ASCVD一、二级预防的一线用药。但近年越来越多研究[3]提示，约有20%ASCVD患者因肌病、肝酶上升等不良反应而不能耐受他汀类药物，被迫降低剂量或停药。此外，部分患者如家族性高胆固醇血症患者即使采用高强度他汀类药物治疗，也难以达到低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C)<1 mg·m L-1的治疗目标[4]。上述原因均直接引起LDL-C降幅减少，达标率下降，更成为高风险患者心血管事件风险升高的重要原因[5]。提高他汀类药物LDL-C达标率及解决其疗效受限问题已成为重要的临床共识[6]。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9）是一种胆固醇代谢负调控因子，通过与低密度脂蛋白受体（LDLR）结合并改变其分子构象，进而通过溶酶体途径促进其降解，导致血中LDL-C的清除减少。有研究[7]发现，他汀类药物上调PCSK9表达水平是其降脂疗效受限的最重要因素之一。地奥心血康（以下简称心血康）为薯蓣科植物黄山药、穿龙薯蓣的根茎提取物，主要含伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷等甾体皂苷类成分，具有活血化瘀、行气止痛的功效，是临床防治冠心病的代表性中成药。本课题组前期研究[8]表明，心血康不仅能改善高脂饮食诱导Apo E-/-小鼠高脂血症和动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）斑块的形成，并能降低小鼠血清PCSK9水平，上调LDLR表达。因此，本研究拟通过高脂饮食饲喂Apo E-/-小鼠复制AS模型，观察心血康联合辛伐他汀对AS小鼠的影响及二者联用的协同效应，并基于PCSK9信号途径探讨其可能的分子机制。

1、材料与方法

1.1动物

SPF级7周龄雄性C57BL/6J小鼠8只和Apo E-/-小鼠32只，体质量20～22 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。动物饲养于成都中医药大学药学院SPF级动物标准饲养平台，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2020-0124，饲养条件：室温（20±5）℃、相对湿度（55±5）%、12 h明暗交替。本实验经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理批文号：2021-77。

1.2药物及试剂

心血康，成都地奥制药集团股份有限公司，批号：190801；辛伐他汀片，杭州默沙东制药有限公司，批号：U018663。高脂饲料（含40%脂肪+0.21%胆固醇），美国Research Diets公司，批号：22020105。总胆固醇（TC）试剂盒（批号：A111-1-1）、甘油三酯（TG）试剂盒（批号：A110-1-1）、LDL-C试剂盒（批号：A113-1-1）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（批号：A112-1-1）、BCA蛋白定量试剂盒（批号：A045-4-2），均购自南京建成生物工程研究所；LDLR抗体，英国Abcam公司，批号：ab52818；肝细胞核因子1α(HNF1α）抗体，美国Cell Signaling Technology公司，批号：89670S；胆固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2）抗体（批号：513049）、山羊抗兔lg G抗体（批号：L05DE73），均购自成都正能生物技术有限责任公司；β-actin抗体，武汉三鹰生物技术有限公司，批号：23001764;PCSK9 ELISA试剂盒，武汉伊莱瑞特有限公司，批号：E-EL-M0634C；油红O试剂盒资料，美国Sigma公司，批号：O0625。

1.3主要仪器

CM1950型冷冻切片机，德国Leica公司；BA210Digital型数码三目摄像显微镜，厦门麦克奥迪实业集团有限公司；Varioska型多功能酶标仪，美国Thermo公司；CFX96型实时荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司；Tissue Iyser-48型多样品组织研磨机，上海净信实业发展有限公司；Mini-P4型电泳槽、Mini-Trans Bolt型转移电泳槽、JY300HE型电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；Chemiscope6100型显影仪，上海勤翔科学仪器有限公司。

1.4分组、模型复制及给药

适应性喂养1周后，将8只C57BL/6J小鼠作为对照组，将32只Apo E-/-小鼠随机分为模型组、心血康组（160 mg·kg-1）、辛伐他汀组（1.3 mg·kg-1）及联合治疗组（心血康160 mg·kg-1+辛伐他汀1.3 mg·kg-1），每组8只。对照组给予常规饲料喂养，其余4组均给予高脂饲料喂养。同时，各给药组均按照上述剂量灌胃给药，对照组、模型组灌胃去离子水，灌胃体积为10 m L·kg-1，每天1次，持续18周。末次给药结束后，采用异氟烷麻醉后处死小鼠，收集血清、肝脏及主动脉组织。

1.5血脂水平检测

严格按照生化试剂盒说明书步骤操作，检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.6油红O染色法观察小鼠主动脉斑块形成及肝脏脂质聚集情况

(1）取用4%多聚甲醛溶液固定的主动脉全体，PBS清洗2次后，用解剖剪将其纵向剖开；用60%异丙醇润洗3 s后，放入37℃预热的油红O工作液中，避光染色60 min;60%异丙醇分化，蒸馏水洗后，采用数码相机采集图像。（2）取用4%多聚甲醛溶液固定的主动脉根及肝脏组织，修剪包埋后，于恒温冰冻切片机内连续切片，厚度为5～6μm；油红O染液浸染10 min，苏木素复染，盐酸-乙醇分化2～3 s，氨水返蓝3～4 s；甘油封片后，采用摄像显微系统采集图像。应用Image-Pro Plus 6.0软件测量斑块和脂滴面积，计算：主动脉全体斑块面积百分比（%）=（油红O阳性面积÷主动脉纵剖面面积）×100%；主动脉根斑块面积百分比（%）=（油红O阳性面积÷主动脉根内膜面积）×100%；肝脏脂滴面积百分比（%）=（肝脏脂滴面积÷肝脏视野面积）×100%。

1.7 ELISA法检测血清PCSK9水平

取小鼠血清以1 000×g离心20 min，收集上清，严格按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，测定血清PCSK9水平。

1.8 q RT-PCR法检测肝脏组织LDLR、HNF1α、SREBP2 m RNA表达水平

按照试剂盒说明书步骤操作，提取肝脏组织总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为c DNA，逆转录反应体系20μL，反应条件为：42℃、2 min,42℃、15 min,85℃、5 s。然后进行PCR扩增反应，反应体系20μL，反应条件为：94～95℃、3 min,94～95℃、5～10 s,60～65℃、20～30 s，共循环40次。以β-actin作为内参基因，根据测得的CT值采用2-ΔΔCT法对目的基因表达进行相对定量分析。引物由北京擎科生物有限公司成都分公司合成，引物序列见表1。

表1引物序列 

1.9 Western Blot法检测肝脏组织LDLR、HNF1α、SREBP2蛋白表达水平

采用RIPA裂解液裂解小鼠肝脏组织，按照BCA蛋白定量试剂盒说明书步骤测定总蛋白浓度。样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜（100 V、90 min），加入5%脱脂奶粉封闭1 h。4℃下孵育一抗（LDLR、HNF1α及SREBP2抗体稀释比为1∶1 000,β-actin抗体稀释比为1∶10 000）过夜，PBST洗涤3次，每次10 min。室温下孵育二抗（羊抗兔lg G，稀释比为1∶10 000)60 min,PBST洗涤3次，每次10 min。加入ECL化学发光液显影，采用多色荧光/化学发光系统扫描；采用Image J图像软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

1.10统计学处理方法

采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验，不符合正态分布用非参数检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1心血康联合辛伐他汀对AS小鼠血脂水平的影响

结果见图1。与对照组比较，模型组小鼠的血清TC、TG、LDL-C水平显著升高（P<0.01),HDL-C水平显著降低（P<0.01）。与模型组比较，心血康组及联合治疗组小鼠的血清TC、TG、LDL-C水平明显降低（P<0.05,P<0.01),HDL-C水平明显升高（P<0.05）；辛伐他汀组小鼠血清LDL-C水平显著降低（P<0.01）。与辛伐他汀组比较，联合治疗组小鼠血清HDL-C水平明显升高（P<0.05）。

图1各组小鼠的血清TC(A）、TG(B）、LDL-C(C）、HDL-C(D）水平  

2.2心血康联合辛伐他汀对小鼠AS斑块形成及肝脏脂滴的影响

结果见图2、图3。对照组小鼠主动脉根和主动脉全体内壁光滑透明，未见AS斑块。与对照组比较，模型组小鼠的主动脉根斑块面积百分比、主动脉全体斑块面积百分比、肝脏脂滴面积百分比均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，心血康组及联合治疗组小鼠的主动脉根斑块面积百分比、主动脉全体斑块面积百分比明显降低（P<0.05,P<0.01）；各给药组小鼠的肝脏脂滴面积百分比均显著降低（P<0.01）。与辛伐他汀组比较，联合治疗组小鼠的主动脉根斑块面积百分比、肝脏脂滴面积百分比均明显降低（P<0.05,P<0.01）。

图2各组小鼠的主动脉根（A）、主动脉全体（B）及肝脏组织（C）的油红O染色代表图 

图3各组小鼠主动脉根（A）、主动脉全体（B）斑块及肝脏脂滴（C）面积百分比情况

2.3心血康联合辛伐他汀对AS小鼠肝脏组织中LDLR表达水平及血清PCSK9水平的影响

结果见图4。与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织中LDLR m RNA及蛋白表达水平显著降低（P<0.01），血清PCSK9水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较，心血康组及联合治疗组小鼠肝脏组织中LDLR蛋白表达水平明显升高（P<0.05），血清PCSK9水平明显降低（P<0.05,P<0.01）。与辛伐他汀组比较，联合治疗组小鼠肝脏组织中LDLR蛋白表达水平显著升高（P<0.01），血清PCSK9水平显著降低（P<0.01）。

2.4心血康联合辛伐他汀对AS小鼠肝脏组织中HNF1α、SREBP2表达的影响

结果见图5。与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织中HNF1α、SREBP2m RNA及蛋白表达水平均明显升高（P<0.05,P<0.01）。与模型组比较，心血康组及联合治疗组小鼠肝脏组织中HNF1α、SREBP2 m RNA及蛋白表达水平均明显降低（P<0.05,P<0.01）。与辛伐他汀组比较，联合治疗组小鼠肝脏组织中HNF1α蛋白及SREBP2 m RNA表达水平均明显降低（P<0.05,P<0.01）。

图4各组小鼠肝脏组织中LDLR m RNA(A）、LDLR蛋白（B）表达及血清PCSK9(C）水平

图5各组小鼠肝脏组织中HNF1α、SREBP2基因（A、B）及蛋白（C、D）表达情况  

3、讨论

针对他汀类药物出现疗效受限及不良反应等问题，临床上常通过联用其他降脂药的方式实现增效或减毒作用[9]。其中，联用PCSK9单克隆抗体被认为是目前最佳的联用增效方案，与单用他汀类药物比较，联合治疗可使LDL-C水平进一步降低20%[10]。但由于PCSK9单克隆抗体成本高昂，皮下给药的依从性亦较差。因此，从中药或天然药物中开发低成本的PCSK9抑制剂具有重要意义。为了探究心血康对辛伐他汀抗AS的协同作用，本研究采用饲喂Apo E-/-小鼠高脂饲料复制AS模型，观察心血康联合辛伐他汀对AS小鼠的影响。本研究结果显示，高脂饲料饲喂养Apo E-/-小鼠18周可引起小鼠高脂血症，诱导主动脉出现明显的AS斑块和肝脏脂滴聚集。给予药物干预后发现，与单用辛伐他汀组比较，联合治疗能一定程度增强其降血脂作用，进一步减缓模型小鼠主动脉根斑块和肝脏脂滴的形成，提示辛伐他汀联合心血康表现出良好的协同增效作用。

PCSK9水平升高及其进一步引起的LDLR降解增加，是临床上他汀类药物疗效受限的关键原因之一[11]。从已有的动物实验报道来看，由于模型复制条件、给药疗程等因素的差异，模型动物呈现出不同的PCSK9变化结果。Gu L等[12]采用高脂饮食饲喂Apo E-/-小鼠4周诱导高胆固醇血症模型，发现10 mg·kg-1辛伐他汀能显著升高小鼠肝脏PCSK9表达水平，但肝脏LDLR表达水平及血清TC、LDL-C水平无明显影响。而Liu DL等[13]研究发现，4 mg·kg-1辛伐他汀治疗高脂血症大鼠8周后，对肝脏PCSK9蛋白表达水平有一定升高趋势（P>0.05），同时依然表现出明显升高肝脏LDLR蛋白表达水平及降血脂的作用。本研究中，采用1.3 mg·kg-1辛伐他汀干预AS小鼠18周后，表现出一定程度升高血清PCSK9水平及肝脏LDLR表达水平的趋势，以及降低血清LDL-C水平的作用。而当辛伐他汀联合心血康后，其降脂和抗AS作用进一步增强，且血清PCSK9水平显著降低，肝脏LDLR表达水平明显升高，提示心血康对辛伐他汀的协同增效作用可能与PCSK9信号途径有关。

SREBP2是LDLR和PCSK9的关键调节因子，可以从转录水平正向调控PCSK9和LDLR[14,15]。除此之外，HNF1α在激活肝细胞PCSK9基因转录中也扮演着重要角色。Shende VR等[16]以Ad-sh HNF1α干扰Hep G2细胞和小鼠HNF1α表达后，可明显下调PCSK9 m RNA表达水平，降低血清PCSK9含量，升高Hep G2细胞及小鼠肝脏LDLR蛋白丰度，而Ad-sh HNF1β干预后则无明显变化。本研究结果显示，饲喂高脂饮食18周可引起Apo E-/-小鼠肝脏组织中SREBP2、HNF1α表达水平显著升高，辛伐他汀干预对二者的表达均无明显影响，而辛伐他汀联合心血康治疗后，能明显逆转SREBP2、HNF1α的变化，且联合治疗组小鼠肝脏组织中HNF1α蛋白及SREBP2 m RNA表达水平均明显低于辛伐他汀组。

综上所述，心血康可能通过抑制SREBP2及HNF1α表达，调节PCSK9/LDLR信号途径，从而发挥对辛伐他汀降脂及抗AS作用的协同效应。本研究结果丰富了心血康的药理学科学内涵，有助于为临床他汀类药物的中西药联用增效策略提供新的思路。

参考文献:

[1]国家心血管病中心.中国心血管健康与疾病报告2021[M].北京:科学出版社,2022.

[9]王增武,刘静,李建军,等.中国血脂管理指南(2023年)[J].中国循环杂志,2023,38(3):237-271.

基金资助:国家自然科学基金青年科学基金项目(82004175);

文章来源:李薇,李璐瑶,瞿礼萍,等.地奥心血康联合辛伐他汀对动脉粥样硬化小鼠的影响及机制研究[J].中药新药与临床药理,2024,35(06):798-804.