动脉粥样硬化（atherosclorosis,AS）是累及全身大中动脉、由脂质代谢异常和炎症引起的慢性炎症性疾病，是心脑血管疾病的重要病理基础[1]。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，AS发病率逐年升高，其引发的心脑血管疾病已成为世界上首位死亡原因，引起了学者们的广泛关注[2]。课题组前期临床研究[3-4]发现，隔药饼灸能降低高脂血症患者血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平，且能稳定高脂血症患者胰岛素样生长因子1(IGF-1）、同型半胱氨酸（Hcy）水平，调节血液流变学指标，纠正血液黏度，维持血管内皮功能稳定，减少心血管事件发生。基础研究[5-7]亦表明，隔药饼灸可调节血脂，降低血清炎症因子、肿瘤坏死因子α(TNF-α）及干扰素γ(IFN-γ）水平，稳定AS易损斑块，修复血管内皮和改善血管内皮功能。但隔药饼灸抗AS机制尚不完全明确。研究[8]发现，高胆固醇血症、高血压、吸烟、饮酒和肥胖等危险因素通过引发氧化应激，促使巨噬细胞迁移并分泌促炎性因子和生长因子刺激诱导内皮功能障碍，诱发AS。炎症反应是AS发生发展过程中的核心因素。而磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在平衡抗炎与促炎中起关键的调节作用[9-10]。AKT经磷酸化活化后触发核糖体进行蛋白合成，激活下游信号分子mTOR的表达，调节细胞增殖、迁移、分化，炎症因子的分泌、释放等过程[11-12]。因此，本研究建立AS兔模型，观察隔药饼灸调节PI3K/AKT/mTOR信号通路对AS兔炎症反应的影响，以期为隔药饼灸临床应用治疗AS提供循证依据，现将研究结果报道如下。

1、材料与方法

1.1 动物

4月龄雄性纯种新西兰大耳白兔24只，体质量2 500～3 000 g，购自湖南太平生物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2020-0005。单笼饲养于湖南中医药大学动物实验中心，室内温度20～25℃，湿度50%～70%。本实验获得湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准通过，审批号：LLBH-202107080003。高脂饲料（按质量分数配比：1%胆固醇、5%猪油、10%蛋黄粉、84%基础饲料），购自北京市昌平区百善镇百善村东科澳饲料厂。

1.2 药物

隔药饼灸的中药材包括泽泻、大黄、郁金、丹参、山楂，购自湖南中医药大学第一附属医院。将各中药材等比例研成粉末，加入醋调成糊状，制成直径0.8～1.5 cm、厚度2.5～3 mm大小的药饼。丙基硫氧嘧啶片，上海朝晖公司生产，批号：H31021082，规格：50 mg/片；阿托伐他汀钙片，天方药业生产，批号：H20051984，规格：10 mg/片。

1.3 主要试剂与仪器

总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL-C等检测试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；TNF-α、白细胞介素6(IL-6）、白细胞介素10(IL-10）等酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；p-AKT抗体、PI3K抗体、p-mTOR抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。VarioskanLUX酶标仪（美国Thermo公司）；Axio Vert.A1倒置荧光显微镜（德国蔡司公司）。

1.4 分组与造模

适应性喂养1周后，将24只新西兰雄兔随机分为正常组、模型组、隔药饼灸组、阿托伐他汀组，每组6只。正常组除外，余下各组制备AS模型[13]。造模方法：高脂饲料中拌入10 mg·kg-1·d-1丙基硫氧嘧啶，连续12周喂养。模型制备成功标准：12周后，随机取样。采血检测血脂指标，模型大鼠血脂含量显著高于正常组（P<0.05）。解剖取主动脉，肉眼见动脉壁内有粥样斑块形成，HE染色见动脉壁内膜不同程度增厚，泡沫细胞浸润及脂质沉积。正常组给予普通饲料喂养。

1.5 干预方法

造模同期，给予治疗。阿托伐他汀组：阿托伐他汀粉末1 mg·kg-1·d-1加入高脂饲料中混合喂养，阿托伐他汀剂量根据人与动物体表面积的等效剂量比值折算[14]，连续12周。隔药饼灸组：高脂饮食喂养基础上给予隔药饼灸治疗。参照《实验针灸学》[15]，选取2组腧穴：Ⅰ组，丰隆、天枢、巨阙；Ⅱ组，肝俞、心俞、脾俞。将药饼置于腧穴之上，艾柱放置药饼上点燃施灸，每穴4壮，约30 min。2组腧穴交替施灸，每日1次，一周6次，连续12周。正常组不给予任何治疗。

1.6 观察指标与检测方法

1.6.1 血脂指标检测

干预结束后禁食12 h，不禁水，腹主动脉采血，以3 000 r/min、4℃离心15 min（离心半径4 cm），取血清。比色法检测血清TC、TG、LDL-C水平，依据试剂盒说明书进行操作。反应结束后，使用酶标仪在510 nm波长处测量样本的光密度（OD），根据OD值绘制标准曲线，计算样本浓度。

1.6.2 炎症指标检测

采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-10含量。具体操作步骤按试剂盒说明书进行，使用酶标仪读取450 nm波长处的OD值。以正常组为相对数值，进行归一化处理，处理后的数据转化为百分比。

1.6.3 HE染色法观察主动脉病理学改变

取血后分离主动脉，4%多聚甲醛固定，乙醇脱水，石蜡浸泡包埋成块，切片烘干，苏木素染色，蒸馏水冲洗，盐酸乙醇分色，1%氨水返蓝，伊红染色，脱水，中性树胶封片，显微镜下观察主动脉组织形态结构变化并拍照存图。

1.6.4 Western Blot法检测心肌组织PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达

取适量心肌组织，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液，离心后取上清，用二喹啉甲酸（BCA）法检测蛋白浓度。将十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离的蛋白通过电转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，电转后的PVDF浸泡在5%脱脂奶粉的封闭液中，孵育1 h。加入稀释的一抗PI3K(1∶500）、p-AKT(1∶1 000）、p-mTOR(1∶2 000）和β-actin(1∶5 000),4℃孵育过夜。洗膜后，加入抗HRP二抗溶液（1∶5 000）室温孵育1 h。洗膜后，加入新鲜配制的增强型ECL发光剂反应2 min，快速于暗室中显影。应用ImageJ软件进行定量分析。

1.7 统计方法

采用SPSS 26.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，两两组间比较选用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组兔血脂水平比较

表1结果显示：与正常组比较，模型组血清中TC、TG、LDL-C水平均显著升高（P<0.001）；与模型组比较，隔药饼灸组、阿托伐他汀组TC、TG、LDL-C水平显著降低（P<0.01或P<0.001）。但与阿托伐他汀组比较，隔药饼灸组TG、LDL-C含量均有所升高（P<0.01),TC含量则无显著变化（P>0.05）。

2.2 各组兔血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比较

表2结果显示：与正常组比较，模型组血清TNF-α、IL-6水平显著升高（P<0.001），血清IL-10水平下降显著（P<0.01）；与模型组比较，隔药饼灸组、阿托伐他汀组血清TNF-α、IL-6含量不同程度下降（P<0.01或P<0.001),IL-10含量显著上调（P<0.05）；隔药饼灸组血清TNF-α、IL-6、IL-10水平与阿托伐他汀组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 各组兔主动脉组织形态结构变化比较

图1结果显示：正常组主动脉血管壁内膜结构完整，中膜层平滑肌细胞排列整齐，无泡沫细胞及脂质、斑块堆积。模型组主动脉血管内膜增厚明显，可见大量泡沫细胞浸润、较多的脂质沉积，平滑肌细胞排列紊乱，提示AS兔造模成功。与模型组比较，隔药饼灸组及阿托伐他汀组主动脉血管内皮结构较完整，少量泡沫细胞积聚，中膜层平滑肌细胞排列较整齐。提示隔药饼灸可减轻AS兔主动脉内膜泡沫细胞形成、管壁内膜增厚、脂质堆积、平滑肌细胞增生。

表1 各组兔血清TC、TG、LDL-C水平比较

表2 各组兔血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比较

图1 各组兔主动脉组织形态结构变化比较（HE染色，×400)

2.4 各组兔心肌组织PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达的比较

图2、表3结果显示：与正常组比较，模型组PI3K、p-mTOR、p-AKT蛋白相对表达量显著降低（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，隔药饼灸组、阿托伐他汀组PI3K、p-mTOR、p-AKT蛋白相对表达量显著升高（P<0.05或P<0.01）；与阿托伐他汀组比较，隔药饼灸组PI3K、p-mTOR、p-AKT蛋白相对表达量无显著变化（P>0.05）。

图2 各组兔心肌组织PI3K、p-AKT和p-mTOR的Western Blot条带

表3 各组兔心肌组织PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达比较

3、讨论

动脉粥样硬化（AS）归属中医学“中风”“胸痹”“眩晕”等范畴，病属本虚标实，与心肝脾肾密切相关。本病多由外邪侵袭、饮食肥甘厚腻、年老体衰、内伤七情等因素影响脏腑功能，导致津液输布失常，凝结为痰，痰浊内阻，停聚于脉道引起。因此，防治AS以调节脏腑、健脾化痰、活血化瘀法为主。本研究应用的药饼中：山楂，主消食健脾、行气散瘀，现代药理表明，其可调节血脂、抗氧化、抑制炎症因子[16-17]；丹参，能破癥除瘕，含有丹酚酸、丹参素等多种降脂抗炎活性成分[18]，与山楂相需相使，共奏活血化瘀之功；大黄，主消食破积，祛瘀生新，其大黄素能改善脂质代谢、抗心肌细胞缺血、延缓AS病变程度[19-20]；泽泻，主利水渗湿、降脂化浊，其提取萜类成分可调节肝脏脂肪合成与代谢、促进胆固醇代谢[21]，与丹参相伍，有祛湿消痰、活血祛瘀之效；郁金，化瘀清心，具有降低血脂、保护血管的作用[22]。药饼、艾灸与腧穴共同作用，达到调畅气血、化瘀消痰之效，从而发挥抗AS目的。

炎症反应参与AS病理生理全过程，适度的炎症有利于提高机体免疫力，过度炎症会影响血管斑块的稳定性，加重血管狭窄。IL-6是一种炎性因子，由单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等多种炎性细胞分泌，参与多种炎症反应，是心血管疾病的独立危险因素[23]。TNF-α主要由活化的巨噬细胞分泌，可促进黏附分子表达，诱导血小板黏附，刺激内皮细胞损伤，参与AS炎症，促进AS的发生进展[24]。IL-10是由单核/巨噬细胞产生的一种抗炎因子，能抑制多种炎性因子的合成，并促进其他抗炎因子的分泌，具有抑制血管壁炎性反应作用[25]。本研究结果显示，隔药饼灸治疗可显著降低AS兔血清IL-6、TNF-α水平，升高IL-10水平，且可调节血脂代谢，减轻主动脉内膜泡沫细胞形成、平滑肌细胞增生，与阿托伐他汀治疗效果相当，提示隔药饼灸可有效改善AS炎症反应及病理损伤。

研究[26]表明，PI3K/AKT信号通路参与血管内皮细胞的炎症损伤并介导细胞炎症性反应的调节过程。PI3Ks是G蛋白偶联受体（GPCR）和受体酪氨酸激酶（RTK）的下游主要效应因子，通过调节磷脂的生成，将各种细胞因子、生长因子的信号转导为细胞内信息。AS的发生发展中，降低PI3K的活性可诱导血管平滑肌细胞异常增殖、迁移和泡沫细胞形成[27]。营养不良、氧化应激、缺氧等因素可影响PI3K的活性，抑制下游AKT的活化，促进内皮细胞凋亡[28]。mTOR是PI3K/AKT信号通路下游关键的自噬负调控因子，激活PI3K/AKT信号通路后，活化的AKT通过磷酸化作用激活mTOR信号通路，从而对自噬产生抑制作用，相反，抑制该通路可诱导自噬的发生[29]。本研究结果显示，隔药饼灸组兔心肌组织PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平较模型组显著上调，且与阿托伐他汀组无显著差异，提示隔药饼灸可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制心肌自噬水平，从而减轻AS炎症反应。

综上所述，隔药饼灸可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，阻断炎症反应进程，修复内皮功能，减少血管平滑肌细胞的迁移和增殖，达到抗AS的目的。但具体的作用机制，还需进一步研究。

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基金资助:国家自然科学基金资助项目(编号:82074559,81704182); 湖南省科技计划项目(编号:2022RC1222); 湖南省中医药管理局一般课题(编号:202206); 长沙市杰出创新青年培养计划项(编号:kq1905036); 湖南中医药大学研究生创新课题(编号:2022CX111);

文章来源:彭涵,易洪芬,陈昕羽,等.隔药饼灸对动脉粥样硬化兔PI3K/AKT/mTOR表达的影响[J].广州中医药大学学报,2024,41(07):1839-1844.