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NO促进糖酵解增强急性中耳炎的炎症应答和细菌清除

2021-06-15 373 上传者：管理员

摘要：目的本研究旨在评估肺炎链球菌性急性中耳炎(S.pnAOM)中一氧化氮(NO)通过促进糖酵解影响细菌清除和炎症应答的作用。方法听泡穿刺接种肺炎链球菌血清型19F建立AOM小鼠模型,荧光定量PCR技术检测中耳灌洗液中中性粒细胞糖酵解相关基因的表达变化。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂1400W及糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2DG)分别处理后,观察糖酵解代谢变化、免疫应答及对细菌清除的影响。结果S.pnAOM时,中耳灌洗液中中性粒细胞呈现糖酵解关键酶、葡萄糖转运体及乳酸分泌转运体等表达上调并伴有葡萄糖消耗增加和乳酸生成增多的免疫代谢特征(P<0.05),同时,iNOS表达显著上调,NO生成增加(P<0.05)。糖酵解促进炎症细胞渗出、细胞因子分泌和S.pn清除(P<0.05)。iNOS抑制剂处理后,NO生成显著减少,糖酵解受抑,炎症反应减轻,细菌清除受损(P<0.05)。结论S.pnAOM时,中耳腔中中性粒细胞糖酵解增强,释放NO促进糖酵解,进而增强中耳炎症应答和S.pn清除。

关键词：
NO
炎症应答
糖酵解
糖酵解增强急性中耳炎
细菌清除
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中耳炎发病机制复杂多样，细菌感染是其发病原因之一[1]。而急性中耳炎是儿童最常见的感染性疾病之一[2]，肺炎链球菌是其最常见的致病菌之一[3]。若急性中耳炎（AOM）久治不愈或反复发作，则造成中耳组织不可逆损伤，引起患儿听力下降、后天性耳聋、语言发育障碍，严重影响患儿生活质量[4]。因此，深入了解AOM的致病机制，将更加有效地预防和治疗AOM。

近年来，越来越多的研究发现活化的免疫细胞，如巨噬细胞，树突状细胞等，在抵抗病原体入侵时发生了“代谢重编程”以供自身能量需要。本课题组前期研究证实[5]，在S.pnAOM中，中性粒细胞作为天然免疫的第一道防线，是控制肺炎链球菌感染的关键效应细胞（≥98%）。然而，在AOM时，募集到中耳腔的中性粒细胞是否发生代谢变化尚无文献报道。有研究发现，脂多糖/γ-干扰素（LPS/IFN-γ）等刺激巨噬细胞和树突细胞（DCs）激活后，糖酵解的转变伴随有iNOS介导NO的产生，它以自分泌或旁分泌的方式使电子传递链复合物亚硝基化，从而抑制线粒体电子传递链，增强糖酵解代谢[6]。并且，有文献报道分泌性中耳炎患者中耳积液中NO表达增高[7]。然而，在AOM中，NO是否可以通过参与调节糖酵解来影响中耳的炎症应答和细菌清除尚不清楚。

因此，本研究利用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-deoxy-D-glucose,2DG）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抑制剂1400W分别处理后，观察糖酵解代谢变化、免疫应答及对细菌清除的影响，初步探讨糖酵解和NO在急性中耳炎中的作用机制，为急性中耳炎的治疗和慢性中耳炎的预防奠定实验基础。

1、材料和方法

1.1动物模型

本实验采用C57BL/6小鼠，6～8周龄，随机分为4组：磷酸盐缓冲液PBS对照组、S.pn感染组、S.pn+2DG处理组和S.pn+1400W处理组，每组小鼠5～6只，腹腔注射1.5%戊巴比妥钠麻醉小鼠，听泡穿刺法将S.pn19F(106CFU/耳）接种于小鼠耳内建立中耳炎模型。将2DG溶于菌悬液后以相同方法接种于耳内（2DG终浓度为32.8mg/ml）。小鼠购自重庆医科大学动物实验中心。小鼠的使用得到重庆医科大学动物中心的许可。

1.2中耳灌洗液上清液的葡萄糖含量测定

采用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量，葡萄糖试剂盒购于普利莱公司，按说明书操作。

1.3中耳灌洗液上清液的乳酸含量测定

乳酸检测试剂盒购于Sigma公司；按说明书操作。

1.4细胞因子测定

通过商业化的酶联免疫反应试剂盒测定MELF上清中IL-1β(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA,#MLB00C),TNF-α(R&DSystems,Min‐neapolis,MN,USA,#MTA00B)和IL-6(R&DSys‐tems)浓度。

1.5荧光定量PCR

采用RNeasyMinikit(Qiagen,Valencia,CA)，按说明书提取中耳灌洗液细胞中总RNA。总RNA提取后进行逆转录及荧光定量PCR，逆转录试剂盒为TAKARA逆转录试剂盒。

1.6免疫荧光

收集至少3只小鼠中耳灌洗液MELF，取100µl甩片，500rpm离心5分钟。干燥5分钟后用4%多聚甲醛固定10分钟。5%正常驴血清37℃封闭1小时，兔抗肺炎链球菌多糖多克隆抗体4℃孵育过夜(1:1000;StatenSerumInstitute,Denmark)。二抗为结合有DyLight488的驴抗兔IgG(1:1000;JacksonImmuno-ResearchLaboratories,WestGrove,PA),37℃孵育1小时。PBS洗涤后DAPI(1:800;Invit‐rogen,USA)复染。尼康ECLIPSE80i采集免疫荧光图像。

1.7统计学方法

所有实验数据采用GraphPadPrismversion5.0(GraphPadSoftware,USA)统计软件行两个独立样本的t检验，所有实验数据用x±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1S.pnAOM中，糖酵解上调

本研究采用听泡穿刺接种成功建立了肺炎链球菌19FAOM小鼠模型。实时定量PCR技术检测中耳灌洗液细胞中糖酵解相关基因的表达，结果显示，在建模后第1天，己糖激酶3(Hk3）、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(Pfkfb3)mRNA表达水平上调（P<0.001），在建模后第3天，丙酮酸激酶2(Pkm2)mRNA表达水平也明显增加（P<0.01），除此之外，乳酸脱氢酶A(Ldha）和乳酸转运体Mct4mRNA水平也呈现上调趋势（图1A）。进一步对MELF中葡萄糖消耗量和乳酸的生成量进行检测，结果表明在建模后第1天，S.pn感染组MELF中葡萄糖的含量明显低于PBS对照组（图1B,P<0.01），而乳酸生成量明显高于PBS对照组（图1C,P<0.05），表明在AOM中，葡萄糖消耗和乳酸产生均增强。上述结果表明AOM时中耳腔募集的中性粒细胞糖酵解相关基因的表达上调，糖酵解增强。

2.2S.pnAOM中，iNOS表达上调

为验证S.pn感染后，中耳腔的中性粒细胞糖酵解增强是否通过增加iNOS表达，释放NO来实现，本研究对中耳灌洗液细胞iNOSmRNA水平进行了检测。结果显示，在中耳炎模型建立后第1、3天，中耳灌洗液细胞中iNOS表达水平均明显上调（图2A,P<0.001），与上述结果一致的是，MELF中NO的量也明显上调（图2B,P<0.05）。而iNOS抑制剂1400W处理后明显降低了中耳灌洗液中NO水平（图2B）。

图1S.pnAOM中，糖酵解上调。

图2S.pnAOM中，iNOS表达上调。

2.3S.pnAOM中，糖酵解促进细菌清除和炎症反应

在急性中耳炎小鼠模型建立后第1、3天，MELF细菌培养计数显示，与S.pn处理组相比，S.pn+2DG处理组中耳腔细菌载量更高（图3A,P<0.01）。中耳灌洗液细胞免疫荧光结果也与此一致，即S.pn单独处理组中耳细菌载量较2DG处理组减少（图3B）。上述结果表明，AOM时，糖酵解可以促进中耳腔细菌清除。而2DG抑制糖酵解后，MELF中炎症细胞数量明显减少（图3C,d1,P<0.05），表明S.pn感染时，糖酵解可以增强炎症细胞渗出。此外，本研究采用ELISA方法检测了小鼠MELF中三种炎症因子的水平，结果显示，在急性中耳炎小鼠模型中，IL-1β，TNF-α和IL-6在MELF中的含量明显增加，而经糖酵解抑制剂2DG处理后，MELF中IL-1β，TNF-α水平则明显降低，但对IL-6无明显影响（图3D,P<0.01）。上述结果表明糖酵解在S.pn诱导的AOM中发挥着促进炎症反应和细菌清除的作用。

图3S.pnAOM中，糖酵解促进细菌清除和炎症反应。

2.4S.pnAOM中，NO通过调节糖酵解促进细菌清除和炎症反应

接下来，本研究使用iNOS抑制剂1400W进一步探索NO在S.pnAOM中的作用。有趣的是，1400W同2DG处理组相似，表现为中耳细菌载量增加、炎症细胞渗出减少及组织损伤减轻。对中耳灌洗液细菌计数发现，1400W处理组细菌载量较S.pn单独处理组明显增加（图4A;d1,P<0.05;d3,P<0.01）。在S.pnAOM的第1天和第3天，1400W处理组中耳灌洗液中炎症细胞渗出明显减少（图4B,P<0.05），炎症因子TNF-a的表达水平降低（P<0.05），与HE染色结果相符，提示NO发挥了促进炎症反应和细菌清除的作用（图4C、D）。

考虑到有研究报道免疫细胞中iNOS表达介导NO的产生可增强糖酵解代谢，因此我们接下来探究在S.pnAOM中，NO是否可以通过影响糖酵解，而非传统的直接杀伤功能发挥作用。如图所示，与对照组相比，1400W处理组中耳灌洗液中NO的表达明显受抑（图5A,P=0.0511）；与此同时，中耳灌洗细胞中Hk3、Mct4的表达明显下调（图5B,P<0.05）。同时，我们发现1400W处理组葡萄糖的消耗和乳酸的产生明显降低（图5C、D;P<0.05）。然而，与对照组相比，2DG处理组中耳灌洗液中NO的表达无显著性差异，提示NO可以通过参与调控糖酵解，进而促进细菌清除和炎症反应。

图4S.pnAOM中，NO通过调节糖酵解促进细菌清除和炎症反应。

图5S.pnAOM中，NO通过调节糖酵解促进细菌清除和炎症反应。

3、讨论

机体的免疫细胞在多数情况下处于相对静息状态，但在遭受感染等刺激时，免疫细胞迅速活化，诱导大量基因表达和生物活性物质释放。细胞从相对静止状态到活化及发挥功能的过程中，需要大量能量供应[8]。近年来，研究发现机体发生感染时活化的免疫细胞（如巨噬细胞，树突状细胞，Th17细胞等）发生了从氧化磷酸化向糖酵解转变的“代谢重编程”以提供能量和中间产物[9]，例如，鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌或结核分枝杆菌等微生物可以强烈诱导小鼠巨噬细胞的糖酵解代谢[10,11]。值得注意的是，上述研究大多关注于巨噬细胞的代谢变化且局限于体外实验。且早在几十年前，就有研究证明中性粒细胞胞质内线粒体数量较少，主要是通过糖酵解来产生自身所需能量[12]。我们在AOM小鼠模型中观察到S.pn感染时，募集至中耳腔的中性粒细胞糖酵解关键酶Hk3、Pfkfb3、丙酮酸激酶2(Pkm2）和葡萄糖转运体Glut1及乳酸转运体Mct4明显上调；葡萄糖消耗和乳酸生成也明显增加，表明募集到中耳腔的中性粒细胞糖酵解代谢增强。

糖酵解不仅对细胞迁移渗出起着调控作用，对细胞免疫功能调控也发挥着重要作用。免疫细胞中糖酵解关键基因和蛋白酶的上调以及中间代谢产物的累积可以影响免疫细胞的功能，包括影响免疫细胞对病原体的吞噬杀伤能力、抗菌物质及炎症因子的释放能力。本研究中，我们采用2DG抑制糖酵解后，中耳腔细菌载量明显增加，炎症细胞浸润明显减少，细胞因子分泌减少，表明糖酵解可能通过增强中耳炎症反应来促进中耳腔S.pn清除，与文献报道一致。

一氧化氮（NO）是一种气体自由基，以L-精氨酸和氧为底物，由诱导型一氧化氮合酶（iNOS）催化合成。中性粒细胞、巨噬细胞、和内皮细胞等多种细胞均能生成NO。一方面，NO具有直接杀菌活性[13]；另一方面，NO可以介导炎症细胞凋亡及促炎因子产生[14,15]。此外，有文献报道，炎性刺激诱导免疫细胞发生糖酵解代谢，还可以通过上调iNOS，增加NO产生，导致电子传递链复合物亚硝基化，从而抑制线粒体呼吸，增强糖酵解代谢[6]。本研究中，我们也发现，S.pn感染后，小鼠中耳灌洗液中性粒细胞，中耳上皮细胞中iNOS水平显著上调，中耳灌洗液中NO水平也明显增高。iNOS抑制剂1400W处理小鼠后，与2DG处理组相似，糖酵解相关基因表达下调，中耳灌洗液中葡萄糖消耗及乳酸生成减少，表明NO的确参与了糖酵解代谢。同时，也发现iNOS抑制剂1400W处理小鼠后，中耳细菌载量增加、炎症细胞渗出减少，但组织损伤减轻表明NO可以促进糖酵解代谢进而促进细菌清除和炎症反应。

总之，本研究表明，在S.pnAOM中，NO不仅具有直接杀菌作用，也可以通过调节糖酵解促进细菌清除和炎症反应，但同时也会加重组织损伤。因此，本研究的结果提示，NO作为一种气体自由基，对AOM的发生发展具有“双刃剑”作用，控制NO的活性可能影响AOM的预后，具有潜在的应用前景。

参考文献：

[1]刘玉红,苏法仁.分泌性中耳炎的相关发病机制及治疗研究[J].中华耳科学杂志,2018,16(02):114-118.

[7]徐万春,王苹,王秀.分泌性中耳炎中耳积液内毒素和一氧化氮测定[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,1998,33(4);212-212.

文章来源：艾容霜,范芳梅,马毓蓉,董益麟,何纤,张欣欣,朱忆婷,李丁一,何於娟.NO促进糖酵解增强急性中耳炎的炎症应答和细菌清除[J].中华耳科学杂志,2021,19(03):480-485.